[发明专利]李氏杆菌病疫苗及制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种疫苗及这种疫苗的制备方法，确切讲是李氏杆菌疫苗及制备方法。

背景技术

李氏杆菌病(Listeriosis)又名旋转病(Circlingdisease)，是由单核细胞增多性李氏杆菌(L.monocytogenes)引起的一种重要的人畜共患传染病。该病发病率较低，但死亡率却很高，各种年龄、不同种类的畜、禽和野生动物以及人均可感染李氏杆菌而发病。家畜主要以幼龄和妊娠母畜较易感，且发病较急，主要表现为脑膜脑炎、败血症和妊娠母畜流产。家禽和啮齿类动物则表现为坏死性肝炎和心肌炎。人感染后症状不一，以脑膜炎为多见。自1926年首次分离到本病病原后，李氏杆菌病现已呈世界性分布。

近年来，因食品污染本菌而引起的食品中毒病例频繁发生，使李氏杆菌病作为一种重要的食物源性传染病在世界范围内对食品安全及人类健康造成极大的危害。对于李氏杆菌病的传播，世界各国予以高度重视并投入大量资金用于研究，以有效防控李氏杆菌病的发生。由于李氏杆菌的血清型变种较多，而且属胞内菌，感染宿主后主要激发的是细胞免疫应答，所以至今尚未有效的疫苗应用于实践。因此，对本病的有效控制已成为当务之急，研制高效、实用、安全的李氏杆菌疫苗已迫在眉睫。

由于李氏杆菌灭活后不能产生溶血素等毒力因子。因此，其灭活疫苗的免疫效价较低，免疫效果不佳。一些研究已证明，以溶血素作为添加剂的灭活疫苗能大大提高灭活疫苗的免疫保护效果，但溶血素本身毒性很强，剂量稍过高就会导致宿主的毒性反应，甚至死亡。因此，本研究以体外表达的P60蛋白作为灭活疫苗的添加剂，使甲醛灭活的李氏杆菌疫苗的免疫保护效果大大提高。

发明内容

本发明提供一种有较高免疫效价、可明显提高李氏杆菌灭活疫苗免疫效果，并有较大安全性的李氏杆菌病疫苗，该疫苗能有效预防动物李氏杆菌病的感染。

本发明涉及的疫苗由P60蛋白100μg，10⁹个李氏杆菌灭活菌及与抗原等体积的佐剂构成。本发明所用的P60为重组蛋白。

本发明的李氏杆菌疫苗的制备方法是：

a.P60重组蛋白制备：

以单核细胞增多性李氏杆菌基因组DNA为模板，以上游引物P1和下游引物P2进行PCR扩增，P1和P2的序列如下：

上游引物P1：5′-ACCGAATTCATGAAAAAAGCAACTATCGCGGCT-3′；

下游引物P2：5′-ACCCTCGAGCTAAGCTTTTCCAAGGTGTTTTTGA-3′

双酶切PCR产物和pET-30a，然后回收目的片段和载体片段，用连接酶连接，将P60基因定向插入pET-30a表达载体，构建成重组表达载体pET-P60，将pET-P60转化BL21(DE₃)感受态细菌后，挑选单菌落，接种含卡那霉素(50μg/mL)的LB培养基中，加IPTG(终浓度为1mmol/L)诱导3～7h。将诱导表达的菌液离心收集菌体，经反复冻融及超声波处理后收集上清，过镍琼脂糖亲和柱，用含有100mmol/L咪唑的缓冲液洗脱，收集洗脱峰得到纯化的P60重组蛋白；

b.单核细胞增多性李氏杆菌的灭活；

取李氏杆菌菌液接入LB培养液中，再在菌液中加入终浓度0.5％的甲醛灭活12小时；

c.取P60重组蛋白、单核细胞增多性李氏杆菌的灭活菌及佐剂进行复配，得李氏杆菌疫苗。

根据相关的实验表明，本发明的疫苗对动物有较好的安全性，同时有较高的免疫效价和免疫保护效果。

具体实施方式

以下为本发明的一个具体制备方法及相关的实验结果。

通过以下实施例对本发明做进一步说明：

本实验中所有相关数据均采用SPSS软件进行统计学分析。

实施例一：入侵相关蛋白P60的制备

1.P60蛋白基因RT-PCR扩增及克隆

入侵相关蛋白P60是根据GenBank中已登录的L.monocytogenes P60蛋白基因序列，设计特异性引物P1和P2，通过RT-PCR扩增并克隆获得的。为下一步亚克隆的需要，分别在上、下游引物中引入EcoR I和Xho I酶切位点，并加有3个保护性碱基，预期扩增长度为1122bp。

P1：5′-ACCGAATTCATGAAAAAAGCAACTATCGCGGCT-3′；

P2：5′-ACCCTCGAGCTAAGCTTTTCCAAGGTGTTTTTGA-3′