[发明专利]一种鉴定康氏木霉纤维素酶系中差异蛋白组分的培养基及其用途

权利要求书

1.一种用于康氏木霉(Trichoderma koningii)生产纤维素酶系诱导相关 蛋白的培养基，包括：

碳源为8.0g的稻草粉、甘蔗渣或秸秆，氮源为4.0g的麸皮，或氮源为 0.5-2g的酵母膏、蛋白胨、硫酸铵或氯化铵，水20ml，其中稻草粉作 为诱导物，自然pH。

2.一种用于康氏木霉(Trichoderma koningii)生产纤维素酶系阻遏相关 蛋白的培养基，包括：

在权利要求1的培养基中加入作为阻遏物的、0.5-10g的葡萄糖，制得 生产纤维素酶系阻遏相关蛋白的培养基。

3.权利要求2的培养基，其中加入低阻遏浓度的0.5-1.5g葡萄糖。

4.权利要求2的培养基，其中加入中阻遏浓度的1.5-4.5g葡萄糖。

5.权利要求2的培养基，其中加入高阻遏浓度的4.0-10.0g葡萄糖。

6.利用权利要求1的培养基生产纤维素酶诱导相关蛋白组分的方法，包括 ：

(1)无菌条件下，在250ml三角瓶中制备上述无菌的纤维素酶诱导培养 基，再接种康氏木霉菌株，在28~30℃发酵4.0~5.0天，每天翻动一次 培养基发酵曲以便通风换气；

(2)将诱导培养基的发酵曲，用100ml pH 4.8缓冲液浸提发酵曲1h、 纱布挤压过滤；

(3)将滤液以12000g离心，获得粗酶液；

(4)用饱和度为20%~80%硫酸铵沉淀粗酶液，并在低于45℃条件下进行 Sephadex G25凝胶脱盐；

(5)旋转蒸发浓缩或者低温冻干浓缩10倍体积，以获得纤维素酶浓缩液 ，其中浓缩液中富含纤维素酶诱导相关蛋白组分；

其中康氏木霉(Trichoderma koningii)菌株选自中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心、保藏号为AS3.2774的菌株。

7.一种生产纤维素酶阻遏相关蛋白组分的方法，包括：

在权利要求6的基础上，使用上权利要求2至5中任一项的阻遏培养基取 代诱导培养基，获得富含纤维素酶阻遏相关蛋白组分的纤维素酶浓缩 液。

8.一种在不同的代谢控制条件下鉴定康氏木霉生产的纤维酶系差异蛋白 的方法，包括：

1)根据权利要求6或7的方法，分别生产纤维酶系的差异蛋白；

2)采用变凝胶梯度双循环电泳分离法来分离纯化纤维素酶系各组分差 异蛋白，即用4%~8%活性梯度胶对纤维素酶粗酶液样品进行电泳、切胶 、凝胶染色定位、切分目的蛋白条带、电泳洗脱、透析、冻干，分别 获得纤维素酶纯酶液的多种蛋白样品；

3)以4%~7%的凝胶梯度对应于低迁移率的待纯化蛋白、或以5%~10%的凝 胶梯度对应于高迁移率的待纯化蛋白，对步骤2)的样品中的一种蛋白 再次进行变凝胶梯度双循 环电泳分离，最终获得纯化的单一活性蛋白样品；

4)对所得的活性差异蛋白进行功能鉴定，鉴定标准为：

将纤维二糖水解为葡萄糖的活性蛋白是β-葡萄糖苷酶，其底物是对硝 基葡萄糖苷；

将纤维素水解产生纤维二糖的活性蛋白是外切酶，其底物是纤维素；

将纤维素水解产生寡聚纤维素或可溶性低聚糖的活性蛋白是内切酶， 其底物是纤维素或羧甲基纤维素。

9.权利要求8的方法，其中用于第1次电泳的浓缩胶的电泳电压为80~100 V，电流为20~30mA；用于第2次电泳的分离胶的电压为180~200V，电流 ＜30mA；电泳缓冲液为pH8.8, 12.5mmol/l Tris-glycin 96 mmo l/l，电泳温度为4℃。

10.权利要求8或9的方法，其中在步骤4)的活性差异蛋白的功能鉴定中：

将微克级的已纯化为电泳纯的活性蛋白在50℃催化水解纤维二糖溶液 24小时以上，经薄层色谱定性检测产物，若产物中有葡萄糖，则判定 该活性蛋白为β-葡萄糖苷酶；或

将微克级的已纯化将已纯化为电泳纯的活性蛋白在50℃催化水解对硝 基纤维二糖苷或纤维素溶液24小时以上，经薄层色谱定性检测产物， 若产物中只有纤维二糖而没有葡萄糖，则判定该活性蛋白为外切酶； 或

将微克级的已纯化将已纯化为电泳纯的活性蛋白在50℃催化水解纤维 素溶液24小时以上，经薄层色谱定性测定，再经3，5二硝基水杨酸定 量检测产物，若产物中有还原糖产生却没有纤维二糖和葡萄糖，则判 定该活性蛋白为内切酶；

其中所述溶液均用0.1mM、pH4.8柠檬酸的缓冲液配制。