[发明专利]胡杨PeCPK10基因的鉴定及其功能研究

说明书

技术领域

本发明设计涉及来自胡杨(Populus euphratica Olive)的PeCPK10基因的鉴定及其功能研究。

技术背景

胡杨(Populus euphratica Olie)是唯一能在干旱盐碱和温差剧烈变化的干旱沙漠地区生长的乔木建群树种。作为天然的抗逆性极强的典型植物，胡杨已引起国际学术界的重视。研究、开发和利用胡杨抗逆性基因资源，对于深入林木抗逆性机理以及定向培育抗逆林木新品种具有重要的价值。钙离子作为细胞内的第二信使在信号转导过程中起着重要作用。钙依赖蛋白激酶(Calcium-Dependent Protein Kinase，CDPK)是植物和一些原生生物所特有的一类丝氨酸/苏氨酸型蛋白激酶，可以不经钙调素的作用而直接被钙信号激活。在逆境下依赖于Ca2+信使的蛋白激酶(CDPK)基因表达量增加，从而促进蛋白质磷酸化产生，激活信号传导途径，最终产生响应蛋白，应答胁迫反应。研究表明，CDPKs在植物逆境胁迫及信号传导过程中起到重要作用。

发明内容

本发明的目的是提供胡杨中的一种与逆境相关的CDPK基因，该基因首次在胡杨中克隆，在抗盐和抗旱反应中具有重要作用。本发明所提供的CDPK基因来源于胡杨，是CDPK基因家族中的一个，命名为PeCPK10。

序列表中序列氨基酸残基序列是由555个氨基酸残基组成的蛋白质，序列表2下划线为直线的序列为其保守的丝氨酸/苏氨酸结构域，其保守的4个EF手性结构域为序列表2中下划线为虚线的部分。

逆境相关基因PeCPK10是下列核苷酸序列之一：

1)序列表中序列1的DNA序列。

2)与序列中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

序列表中序列1的DNA序列由1668个碱基组成，为该基因的开放读码框序列，含有典型CDPK结构域(丝氨酸/苏氨酸激酶区和EF手性结构区)序列，其表达受到干旱和盐的诱导。

本发明所提供的逆境相关基因PeCPK10，使用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的表达载体(包括双元农杆菌载体以及用于单子叶植物微弹轰击的载体)转化植株，可获得对高盐和干旱胁迫抗性增强的转基因植株。本发明的基因在构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种强启动子或诱导型启动子。本发明的基因在构建到植物表达载体中时，可以使用增强子，但是必须与编码序列的阅读框相同，要保证整个序列的翻译。

为了便于对转基因植物细胞或植株进行鉴定及筛选，可以在构建载体时对载体进行加工，例如加入可选择性标记，通常使用的可选择性标记可以是编码对抗生素(包括庆大霉素、卡那霉素、潮霉素)抗性酶的基因，也可以是GUS、GFP等可以产生颜色变化的酶或发光化合物的基因等。

携带有本发明的逆境相关基因PeCPK10基因的表达载体可以通过多种方法转化植物宿主，以培育抗盐或抗旱的植物品种，例如Ti质粒、Ri质粒、电穿孔、微注射、植物病毒载体、直接DNA转化或植物病毒载体等，所转化的植物宿主可以是单子叶植物也可以是双子叶植物。

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明：

附图说明

图一是通过RT-PCR技术克隆得到的基因全长电泳图，图中M为markerD2000，1为与逆境相关的基因PeCPK10；

图二为PeCPK10基因在干旱条件下RT-PCR检测结果；

图三为PeCPK10基因在高盐条件下RT-PCR检测结果。

具体实施方式

实施例1，胡杨总RNA的提取

用CTAB(萨姆布鲁克，分子克隆实验指南，第三版)的方法从干旱处理的胡杨中提取总RNA。

实施例2，胡杨PeCPK10 cDNA序列的克隆