[发明专利]一种人胎盘提取液的病毒灭活方法

权利要求书

1.一种胎盘提取液的病毒灭活方法，包括使胎盘提取液与固定化的核酸酶进行酶解反应。

2.一种胎盘提取液的病毒灭活方法，包括如下顺序进行的步骤：

1)采用Trizol RNA抽提试剂提取牛胰腺的总RNA；

2)牛胰腺的总RNA的RT-PCR扩增；

3)将牛胰腺总RNA的RT-PCR扩增产物克隆到细菌中，制备牛核糖核酸酶A的表达细菌；

4)对牛核糖核酸酶A的表达细菌进行诱导处理，然后将细菌破碎细胞产生的核酸酶与水不溶性材料固定，获得固定化牛核糖核酸酶A；

5)胎盘提取液病毒与固定化牛核糖核酸A进行酶解反应，而灭活。

3.如权利要求2所述的灭活方法，其特征是，步骤1)中牛胰腺总RNA按照如下步骤提取得到：

A)向牛胰腺组织中加入Trizol RNA抽提试剂反复吹打牛胰腺组织至液体中无细胞团块，制得牛胰腺组织混合物；

B)将牛胰腺组织混合物进行匀浆处理，向匀浆液中加入氯仿，然后进行离心处理，获得第一上清液；

C)向第一上清液中加入异丁醇，然后进行离心处理，获得第二沉积物；

D)向第二沉积物中加入乙醇溶液，然后进行离心处理，获得牛胰腺总RNA。

4.如权利要求3所述的灭活方法，其特征是步骤D)中所述乙醇溶液为体积质量百分比浓度为75％的DEPC水溶液，其中，DEPC水溶液的体积质量百分比浓度为1‰。

5.如权利要求2或3所述的灭活方法，其特征是步骤2)中所述牛胰腺总RNA的RT-PCR扩增包括如下进行的步骤：

A)将牛胰腺总RNA与Oligo(dT)15、dNTP、RNasin、M-MLV反转录酶混合，进行逆转录反应，获得逆转录RNA；

B)向逆转录RNA中加入MgCl₂、dNTP、上游引物、下游引物、cDNA模板、Taq酶和水混合均匀后，进行所述的RT-PCR扩增反应，获得牛胰腺RNA的RT-PCR反应产物。

6.如权利要求2或3所述的灭活方法，其特征是步骤3)中所述牛核糖核酸酶A表达细菌按照如下步骤获得：

A)用限制性核酸内切酶EcoR1、限制性核酸内切酶HindIII酶水解牛胰腺RNA的RT-PCR反应产物和pET28a质粒，获得牛胰腺RNA的PCR产物DNA片段和pET28a载体DNA片段；

B)将T4DNA连接酶加入到牛胰腺RNA的PCR产物DNA片段、pET28a载体DNA片段中，进行连接反应，获得牛胰腺DNA连接物；

C)将牛胰腺DNA连接物置于于大肠杆菌的培养基中，进行大肠杆菌的培养，获得牛核糖核酸酶A的表达细菌。

7.如权利要求2或3所述的灭活方法，其特征是步骤4)中所述固定牛核糖核酸酶A包括如下步骤进行：

A)在牛核糖核酸酶A表达细菌的对数生长中期，加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，进行诱导处理，获得牛核糖核酸酶A表达细菌细胞；

B)牛核糖核酸酶A表达细菌细胞进行超声处理，使细胞破碎后，进行离心处理，收集上清液，获得牛核糖核酸酶A粗酶液；

D)将牛核糖核酸酶A粗酶液通过Ni-NTA柱，牛核糖核酸酶A固定于Ni-NTA柱上，获得固定化牛核糖核酸酶A。

8.如权利要求2或3所述的灭活方法，其特征是步骤5)中所述胎盘提取液病毒核酸酶解灭活为使胎盘提取液与固定化牛核糖核酸酶A接触，胎盘提取液中病毒的核酸被牛核糖核酸酶A酶解而灭活，制得病毒灭活胎盘提取液。

9.如权利要求2或3所述的灭活方法，其特征是还包括将固定化牛核糖核酸酶A用生理盐水清洗，使固定化牛核糖核酸酶A再生。

10.一种胎盘提取液，其特征是按照如权利要求1-9任一所述病毒灭活方法使胎盘提取液中病毒灭活而成。