[发明专利]一种尖孢镰刀菌的筛选方法及其应用

权利要求书

1.一种尖孢镰刀菌的筛选方法，包括：

采集砷污染土壤样品，在实验室内从所述土壤样品中分离出真菌，在固态PGP培养基上将分离出的真菌与浸有不同浓度砷的滤纸片作用，观察真菌在不同浓度砷胁迫下的菌落生长状况，由此筛选出尖孢镰刀菌。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，具体包括：

将所述土壤样品经梯度稀释后涂布于砷含量为400～600mg/L的马丁培养基上分离出真菌；

将分离出的真菌经反复纯化、培养后，取直径为5～7mm的圆形菌块或边长为5～7mm的方形菌块放于所述PGP培养基上，在距所述菌块为1～3cm处分别放置浸有不同浓度砷溶液的直径为2～4mm的圆形滤纸片，所述砷浓度的范围设置为1000～30000mg/L；将所述PGP培养基于24～26℃下培养5天后，通过观察菌株的生长情况筛选出所述尖孢镰刀菌。

3.按照权利要求2所述的方法，其特征在于，所述马丁培养基的成分包括：葡萄糖、蛋白胨、KH₂PO₄、MgSO₄·7H₂O、琼脂以及水，各成分的重量比为5∶10∶2∶1∶80∶4000；

所述PGP培养基的成分包括：马铃薯、葡萄糖、蛋白胨以及水，各成分的重量比为40∶4∶1∶400。

4.一种尖孢镰刀菌对砷的抗性的鉴定方法，包括：

在室内培养条件下测定尖孢镰刀菌对砷的生物累积与挥发能力，以及在含有不同浓度砷的溶液的培养条件下尖孢镰刀菌生物量的变化，由此鉴定所述尖孢镰刀菌对砷的抗性。

5.按照权利要求4所述的方法，其特征在于，所述在室内培养条件下测定尖孢镰刀菌对砷的生物累积与挥发能力，具体包括：

配制总砷含量为50mg/L的PGP培养基，在120～125℃下灭菌13～17分钟后，接入0.1mL尖孢镰刀菌生物量为10⁴cfu/mL的菌悬液，培养温度为23～27℃，转速为138～142rmp，振荡培养5天后，以3800～4200rmp进行离 心处理8～12分钟，用超纯水反复清洗菌质4次，洗掉残留的培养基，将所述菌质于48～52℃下烘干至恒重，然后对所述菌质称重，用11～13mL体积比为4～6∶1的HNO₃、HClO₄混合液在158～162℃条件下将所述菌质消煮10小时，采用原子荧光测定所述菌质中的总砷含量；将离心出的培养液及清洗所述菌质的超纯水混合后作为上清液采用所述原子荧光测定总砷含量；

所述菌质中的总砷含量作为尖孢镰刀菌对砷的生物累积量，尖孢镰刀菌对砷的挥发量＝配置的总砷含量-所述菌质中的总砷含量-所述上清液中的总砷含量。

6.按照权利要求5所述的方法，其特征在于，

参照在所述总砷含量为50mg/L的PGP培养基中接入尖孢镰刀菌的处理，分别以在所述总砷含量为50mg/L的PGP培养基中不接入尖孢镰刀菌处理以及在PGP培养基中接入尖孢镰刀菌而不配置砷含量的处理作为对照，对每项处理均重复多次。

7.按照权利要求4所述的方法，其特征在于，在室内条件下测定在含有不同浓度砷的溶液的培养条件下尖孢镰刀菌生物量的变化，具体包括：

配制总砷含量范围为0～200mg/L的PGP培养基，在120～122℃下灭菌14～16分钟后，将相同厚度且生长速率相同的直径为5～7mm的尖孢镰刀菌菌饼分别加入所述培养基中，于摇床上温度为23～27℃、转速为138～142rmp振荡培养；培养5天后，培养液以3800～4200rmp离心10分钟，并采用稀释梯度法计数菌悬液中尖孢镰刀菌的孢子数目，即表达所述尖孢镰刀菌生物量；

用超纯水反复清洗菌质4次，洗掉残留的培养基后，将所述菌质于48～52℃下烘干至恒重，然后称量所述菌质重量，即所述尖孢镰刀菌生物量重量。

8.按照权利要求7所述的方法，其特征在于，

不同的总砷含量的相应的处理均重复多次。

9.按照权利要求8所述的方法，其特征在于，还包括：

观察随着培养溶液中总砷含量的增加，所述尖孢镰刀菌的生物量的变化 趋势，并观察所述尖孢镰刀菌的生物量最高的总砷含量，由此确定所述尖孢镰刀菌表现出较强的对砷的抗性的总砷含量范围。

10.一种尖孢镰刀菌在砷污染土壤治理以及降低砷在作物及农产品中累积方面的应用。