[发明专利]海水中病毒的浓缩方法及病毒浓缩回收率的测定方法

权利要求书

1.一种海水中病毒的浓缩方法，该方法包括：

取水样10L用双层纱布过滤水样至玻璃缸中；用1mol/L HCl将10L海水样品的pH调至3.5；加入终浓度为0.0005mol/L的AlCl₃，混匀；静置30min后，用净水器通过蠕动泵抽滤；海水全部滤过后，用pH为10.4的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液洗脱；洗脱液置于透析袋中用PEG-6000透析；在4℃条件下，将洗脱液浓缩至2mL左右，立即检测或-20℃冻存。

2.根据权利要求1所述的方法进行的海水的预处理。

3.海水中病毒浓缩回收率的测定方法，该方法包括：

(1)制备阳性对照和阴性对照：用添加病毒减毒活疫苗的海水作为阳性对照，未添加病毒减毒活疫苗的灭菌海水作为阴性对照；

(2)用权利要求1所述的浓缩方法将添加病毒减毒活疫苗的海水和未添加病毒减毒活疫苗的海水进行浓缩，得到浓缩样品；

(3)病毒PCR引物设计位于HAV基因组中编码V1-V3衣壳蛋白的区域，目的片段长度为76bp；

(4)HAV标准曲线的建立：用EASY-Dillution将已知拷贝数的重组质粒作10²～10⁷6个梯度的稀释；

20μL RT-PCR反应体系为：10.0μL的SYBR Premix Ex Taq(2×)、引物各0.4μL、0.4μL的ROX Reference Dye II(50×)、质粒模板2.0μL和灭菌水6.8μL；

反应条件：95℃10s，95℃15s，60℃1min，40个循环，熔解曲线分析条件为95℃10s，60℃1min，95℃15s；

(5)根据标准曲线计算样品中病毒的拷贝数，从而计算海水样品中病毒的回收率。

4.根据权利要求3所述的病毒浓缩回收率的测定方法，其中病毒为甲型肝炎病毒。