[发明专利]肠病毒类病毒颗粒的制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及应用杆状病毒重组蛋白表达系统来制备肠病毒71型类病毒颗粒、制造方法及其应用。

背景技术

肠病毒(Enterovirus)在分类上属于微小核糖核酸病毒科(Picomaviridae)，为单正股(positive，single strand)RNA病毒，感染途径主要通过粪便或呼吸道飞沫传染，能够感染人体多种系统器官，甚至造成器官功能衰竭的现象。传统上使用中和血清试验可将肠病毒分为脊髓灰白质炎病毒型(Polioviruses，PV)，克沙奇病毒A型(Coxsackieviruses A，CAV)，克沙奇病毒B型(Coxsackieviruses 2B，CBV)，人类肠道细胞致病性孤儿病毒(Enteric cytopathogenic human orphan viruses，即伊科病毒Echoviruses)，及68-71型肠病毒等。在肠病毒各血清型中，肠病毒71型的致病力特别高，常伴随着神经系统的并发症且有致死的可能。

肠病毒71型病毒颗粒是直径约为25-27nm的二十面体聚合大分子，但其详细组成等信息尚未清楚研究。目前对肠病毒的了解主要来自脊髓灰白质炎病毒(即小儿麻痹病毒)。根据小儿麻痹病毒的研究，肠病毒基因组全长约7500nt，包括单一开放读码框架(open reading frame，ORF，约6600nt)，两侧则分别为5’与3’未翻译区(untranslated regions，UTR)。此ORF可分为三区域：P1，P2及P3，并会被翻译为单一的多蛋白(polyprotein)。P1带有病毒壳蛋白：VP4，VP2，VP3及VP1。P2及P3则带有非结构性蛋白质如水解蛋白(protease)2A、3C、与3CD，以及病毒聚合脢3D^pol，主要负责病毒的复制并产生病毒毒性。以小儿麻痹病毒为例，肠病毒颗粒理论上是由60个VP1及VP3、58-59个VP2及VP4，与1-2个VP0分子(VP2及VP4未分开前的前趋物)所形成。VP1、VP2与VP3均位于病毒壳外层，而VP4则完全位于内层。对目前已研究较多的肠病毒，如小儿麻痹病毒、CAV与CBV，已有许多中和抗原决定部位(neutralization determinants)被发现主要位于VP1另有少数位于VP2与VP3。此外，这些结构蛋白质亦与病毒毒性减弱、病毒热稳定性、宿主范围、细胞驱向性等有关。

昆虫杆状病毒(baculovirus)一般简称为杆状病毒，属于杆状病毒科(Baculoviride)，其宿主局限于无脊椎动物，其中又以鳞翅目昆虫为其主要宿主。杆状病毒科可分成两个属，分别是颗粒体病毒属(Granulovirus，GV)以及核多角体病毒属(Nucleopolyhedrovirus，NPV)组成，差别在于包埋体蛋白质的不同。前者的包埋体较小，约为0.25-0.5μm，只包埋一颗病毒粒子；后者较大，约为1-15μm，主要由大小约为29kD的多角体蛋白(polyhedron)所组成，可以包覆较多的病毒粒子。NPV以其独特的感染周期及基因表达方式，可在稳定的细胞株中培养，使其具有发展为基因表达载体的潜力。目前最常作为杆状病毒表达载体的病毒是苜蓿尺蠖蛾核多角体病毒(Autograph californica nuclear polyhedrosis virus；AcMNPV)和家蚕核多角体病毒(Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus；BmNPV)，其主要宿主分别为蛾类和家蚕。

NPV的遗传物质为双股环状结构的DNA，大小约80-200kb，由长杆状蛋白鞘(nucleocapsid)包覆在内，外层再由脂蛋白被膜(lipoprotein envelope)所包覆，形成长约40-50nm，宽约200-400nm的病毒结构。病毒在感染细胞后可产生出两种形态的病毒粒子：出芽型病毒粒子(budded virion；BV)与封埋型病毒粒子(occlusion body-derived virus；OV)。出芽型病毒粒子产生于感染周期的早期，感染后新生的nucleocapsid会由细胞核膜释出到细胞质里，并进一步穿出细胞膜；封埋型病毒粒子则产生于感染周期的后期，且其会被包埋在大小约30kDa的多角体蛋白质或晶形结构的蛋白质中，形成大小约1-15μm的多角体(polyhedron)或称之为封埋体。而实验室常用的杆状病毒均为出芽型病毒粒子。