[发明专利]编码兔肝细胞生长因子的cDNA及其表达载体和应用

说明书

技术领域

本发明涉及编码细胞生长因子的cDNA，尤其涉及编码兔肝细胞生 长因子的cDNA及其表达载体和应用，属于基因工程领域。

背景技术

肝细胞生长因子(HGF)是继血管内皮细胞生长因子(VEGF)和成 纤维细胞生长因子(FGF)之后成为心脏病基因治疗中新的研究热点。 HGF最初从大鼠血浆和血小板中分离得到，是一种分泌型肝素亲和糖 蛋白，又称为扩散因子(Scatter factor，SF)。1984年，Nakamura等 从部分肝切除大鼠的血清中分离到一种能刺激原代培养的肝细胞生 长和合成的肝源性因子，并首次将它正式命名为肝细胞生长因子 (HGF)。1989年，Nakamura成功地克隆出人和大鼠HGF的cDNA，并推导 出它们全部的氨基酸序列，发现二者结构相同，为同一物质。HGF是一 种具有多种生物学功能的细胞因子，如促细胞分裂剂、促细胞运动剂 和促形态形成剂等作用。它可以促进肝细胞及多种内皮细胞、上皮细 胞的分裂、分化及形态发生，参与肝脏及其他重要组织器官损伤后的 修复和生理条件下死亡细胞的再生。它具有抗凋亡特性，抗纤维化作 用，调节细胞生长和运动，在肿瘤转移及损伤修复中起着重要作用。 HGF的受体是c-Met受体，随着对HGF/c-Met系统研究的深入，现已知 c-Met主要在各种上皮细胞中表达，而其配体HGF则在间质细胞中表 达。这种相互配对表达的关系说明HGF/c-Met系统在上皮与间质的相 互作用中具有重要的生物学意义，如HGF/c-Met系统可促进胎盘和胚 胎的发育，调节肺、肾和乳腺等器官的发育和结构的形成，促进神经系 统和肌肉的发育，调节造血干细胞的增殖和分化，促进新生血管的形 成等。近来研究发现HGF还是一种心肌营养因子，在心肌梗死中起着重 要作用，并且血中HGF水平与高血压的发生、发展及其严重程度有关。 HGF在某些方面要优于VEGF。HGF作为另一种内皮细胞特异性的生长因 子，其血管生成作用和抗纤维化及心肌保护作用都显示出巨大潜力， 在血流动力学研究中与VEGF比较，二者对平均动脉压、心率、心脏功 能及红细胞压积等方面的影响有相似之处，但其副作用较后者小，且 副作用持续时间较后者短，显示出比VEGF更大的优越性，并且VEGF基 因有使膜通透性亢进的不良反应，而HGF则无此现象。

基因治疗是近10余年来广泛研究并取得一定进展的治疗心肌梗 死的新方法。经过大量的临床前研究和临床试验，血管生成基因治疗 已经成为治疗冠心病和外周血管病很有潜力的治疗方法。HGF是一种 多功能细胞因子，HGF具有促进血管内皮细胞增生的作用，临床上可 用于防止冠状动脉血管术后狭窄及防止和治疗动脉硬化，具有抗纤维 化作用而用于治疗心肌梗死。Nakamura等发现体外HGF可促进人大动 脉及大鼠冠状动脉血管内皮细胞具有促有丝分裂且不引起血管平滑 肌细胞增殖作用。通过导入外源性的细胞生长因子或基因，即所谓的 ″基因搭桥″，可改善缺血区的供血，从而保护残存心肌，改善心功能。

本发明人拟应用已有建立兔慢性心肌缺血模型的实验方法的基 础，研究利用HGF促进治疗心肌梗死的新方法。尽管来源于人或鼠的 HGF在兔的组织器官上呈现一定的交叉活性，但使用同种来源的兔HGF 可以达到最高活性，产生最小的可能副作用，是用于兔模型的最佳选 择。通过GenBank和文献查阅，已有人、鼠、猫、狗、猪、马等HGF序 列记录，但没有兔HGF的序列。

发明内容

本发明的目的之一是提供编码兔肝细胞生长因子的cDNA。

本发明的目的之二是提供含有上述编码兔肝细胞生长因子的 cDNA的表达载体。

本发明的目的之三是将上述编码兔肝细胞生长因子的cDNA用于 制备成促进细胞生长的药物。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明人首先根据人和小鼠HGF的核酸序列，找出其保守区，以 此设计引物，应用5’RACE法，扩增和克隆了未知的兔HGF cDNA的5’ 片段。对该片段进行核酸序列测定后，以此为基础设计了兔HGF的3’ RACE引物，扩增和克隆了剩下的HGF cDNA的3’片段。最后将克隆的 5’和3’cDNA片段连接，测序获得了两种全长的兔HGF cDNA序列，分 别命名为兔HGF-1(2299bp)(SEQ ID NO：1)和兔HGF-2(2320bp)(SEQ  ID NO：2)。