[发明专利]克服苜蓿品种基因型限制高频体胚再生培养方法

权利要求书

1.一种克服苜蓿基因型限制高频体胚再生培养方法，包括以下步骤：

(1)选材：苜蓿成熟种子经冲洗、消毒杀菌、干燥后，在幼苗生长驯化培养基上培养无菌苗，选取萌发后的无菌苗的上胚轴、下胚轴和再生植株叶片三种外植体；

(2)体细胞胚胎发生诱导：将上述选取的外植体接种于体细胞胚胎发生诱导培养基上，在室温27±2℃的条件下暗培养26～28天；

(3)胚继代形成培养：将上述经体细胞胚胎发生诱导培养后的外植体接种于胚继代形成培养基上，首先进行5天的4～8℃低温人工气候箱暗培养，然后在室温27±2℃的条件下暗培养28～30天；

(4)胚成熟萌发成苗培养：将上述经胚继代形成培养后的外植体接种于胚成熟萌发成苗培养基上，在白天室温27±2℃、夜晚20±1℃、光照强度为1000～1500lx的条件下进行16h/d的光培养30～40天，形成幼苗；

(5)幼苗生长-驯化培养：将上述经胚成熟萌发成苗培养后的幼苗转接到幼苗生长驯化培养基上进行壮苗生根培养，形成生根的再生植株；

(6)生根的再生植株移栽、成活；

所述的幼苗生长驯化培养基为：1/2改良MS+20g/L白糖+0.7％琼脂；

所述的体细胞胚胎发生诱导培养基为：改良SH+6～10mg/L 2，4-D+0.2～0.5mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+0.3％phytagel；

所述的胚继代形成培养基为：改良SH+2～5mg/L 2，4-D+0.2～0.5mg/L6-BA+500mg/L水解酪蛋白+50g/L蔗糖+0.35％phytagel；

所述的胚成熟萌发成苗培养基为：改良MS+500mg/L水解酪蛋白+30g/L白糖+0.7％琼脂。

2.根据权利要求1所述的克服苜蓿品种基因型限制高频体胚再生培养方法，其特征在于所述的改良SH包括常量营养元素、微量营养元素和有机试剂。

3.根据权利要求2所述的克服苜蓿品种基因型限制高频体胚再生培养方法，其特征在于所述的常量营养元素的组分和其对应的浓度如下：

硫酸铵                    463mg/L；

硝酸钾                    2830mg/L；

二水氯化钙                166mg/L；

七水硫酸镁                185mg/L；

无水磷酸二氢钾            400mg/L；

乙二胺四乙酸铁钠盐        1.4mg/L。

4.根据权利要求2所述的克服苜蓿品种基因型限制高频体胚再生培养方法，其特征在于所述的微量营养元素的组分和其对应的浓度如下：

一水硫酸锰                10mg/L；

硫酸锌                    1.0mg/L；

硼酸                      5.0mg/L；

碘化钾                    1.0mg/L；

钼酸钠                    0.1mg/L；

硫酸铜                    0.2mg/L；

氯化钴                    0.1mg/L。

5.根据权利要求2所述的克服苜蓿品种基因型限制高频体胚再生培养方法，其特征在于所述的有机试剂的组分和其对应的浓度如下：

盐酸硫胺素                5.0mg/L；

烟酸                      5.0mg/L；

盐酸吡哆醇                5.0mg/L；

肌醇                      1.0mg/L。

6.根据权利要求1所述的克服苜蓿品种基因型限制高频体胚再生培养方法，其特征在于所述的改良MS培养基包括常量营养元素、微量营养元素和有机试剂。