[发明专利]冬虫夏草的鉴别及检测方法和试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种定性及定量检测冬虫夏草的方法以及用于该方法的试剂盒。

背景技术

冬虫夏草是麦角菌科中华虫草菌(Cordyceps sinensis(Berk.)Saccardo(1878))寄生在鳞翅目、蝙蝠蛾科、蝠蛾属(Hepialus)昆虫幼虫体产生的子座及幼虫尸体的复合体。在中药材市场上，利用其人工发酵培养的无性型菌丝体以及与冬虫夏草形态相似的近缘种(如亚香棒虫草(又名霍克斯虫草)C.hawkesii Gray、戴氏虫草C.taii Z.Q.Liang & A.Y.Liu、古尼虫草C.gunnii(Berk.)Berk.、凉山虫草C.liangshanensis Zhang & Liu)等假冒伪劣品充斥市场，甚至出现地蚕、白僵蚕、压模“虫草”等伪劣产品，造成冬虫夏草药材及其加工成药市场混乱，严重损害消费者、产地及加工企业的利益。

另一方面，全世界目前已报道发现由虫草属真菌(Cordyceps)寄生于昆虫、蜘蛛和其他生物长出子实体的虫草种类达400多种，其中我国已记录68种。在国内外一些人和学者的概念中，把凡是由虫草属真菌寄生并能产生子实体的菌物结合体都通称为冬虫夏草。然而，中国传统的中医药学和我国绝大部分学者和人们所指的冬虫夏草，是特指仅分布于我国青藏高原及边缘地区高寒草甸中的、具有特殊药用功效的中华虫草菌(C.sinensis)，其他类群仅称为虫草，不是正宗的冬虫夏草。

为解决上述问题，2000年11月12日公开的中国专利申请公开第CN 1274010号公开了一种鉴别冬虫夏草的特征性核苷酸序列和方法，该发明以冬虫夏草rDNA及其间隔区(非编码区)特异性序列为鉴别特征，并以此为基础设计专一性扩增鉴定引物，建立以普通PCR为技术基础的鉴定方法。然而，该方法具有以下局限性：(1)通过PCR扩增之后，必须进一步经过DNA测序(需要2-3天)，或者经过凝胶电泳(1.5小时左右)才能判别结果，不能在PCR扩增的同时即能实现结果的判断，因此，检测速度和效率上受到一定的制约；(2)该方法是一种定性的检测方法，即只能检测冬虫夏草“有”还是“无”，不能在技术上进一步定量检测其含量；(3)由于冬虫夏草rDNA的间隔区序列较短并且引物设计困难，普通PCR扩增鉴定序列长度一般在300bp左右，对于以冬虫夏草为原料的加工处理过的产品，其核酸可能严重降解至300bp以下，此时，采用普通PCR技术无法实现DNA链的扩增，导致检测结果不准确；(4)该方法需对常规PCR产物进一步实施凝胶电泳，其过程涉及核酸染料等有毒物质的操作工序，容易造成污染，对人体具有一定的危害性。

现实需求表明，在冬虫夏草流通和加工过程中，迫切需要建立快速、准确地既能鉴别冬虫夏草真伪，又能明确其含量的分子鉴定技术，这对于对保障消费者利益，保护我国传统中药材的产权利益并促进其市场化发展具有至关重要的意义。

发明内容

本发明的目的是解决现有技术中存在的问题，提供一种能快速、准确地鉴别和检测冬虫夏草的方法、以及鉴别和检测冬虫夏草用的试剂盒。

为实现上述本发明的目的，一方面，本发明提供了一种冬虫夏草的鉴别和检测方法，该非法包括如下步骤：

(a)从待测样品中提取出核糖体DNA；

(b)以步骤(a)中获得的DNA为模板，使用SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对和SEQ ID NO.3所示的探针进行实时荧光PCR反应，得到扩增产物；

(c)根据扩增产物的荧光的有无和强度来判断是否为冬虫夏草及其含量。

在上述本发明的方法中，其所采用的用于实时荧光PCR扩增的引物对及探针序列如下所示：

SEQ ID NO.1(正义引物)：5’-CAAGGTCTCCGTTGGTGA-3’

SEQ ID NO.2(反义引物)：5’-AACTGCTGTGGTGTTCGC-3’

SEQ ID NO.3(荧光探针)：

5’-Fam-CGGAGGGATCATTATCGAGTYACCACT-Tamra-3’

上述引物可在冬虫夏草核糖体DNA上特异性地扩增出80bp的产物，利用上述探针可判断待测样品的真伪以及检测样品中冬虫夏草的含量。

在本发明的一个实施方式中，步骤(a)中提取出的核糖体DNA的浓度至少为0.0001ng/μl。在本发明的一个实施方式中，所述引物对位于核糖体DNA的18S rDNA和5.8S rDNA之间的间隔区内。在本发明的一个实施方式中，步骤(b)中得到的扩增产物的核苷酸长度为80bp。