[发明专利]一种根瘤固氮菌株系RY1菌株及其应用

说明书

技术领域

本发明属于植物营养和牧草栽培技术领域，具体涉及一种生物固氮技术，尤其是涉及一种能使柱花草高效结瘤并达到高产的根瘤菌。 

背景技术

柱花草(Stylosanthes guianensis SW.)又名热带苜蓿、巴西苜蓿，原产于南美洲。1982年由中国热带农业科学院引自从国际热带农业中心(CIAT)，并在海南试种成功，现在已大面积推广于华南各省(区)。柱花草在盛花期的干物质中含粗蛋白质16.0～20.0％，粗脂肪1.8～2.5％，租纤维17.0～19.0％，无氮浸出物38.0～44.0％，粗灰分8.0～10.0％，是一种优良的热带豆科牧草。中国南方如广东、广西等省(区)，将柱花草与果树间种，除了用于饲草外，还可起到覆盖、保持水土和改土培肥的作用。如果与禾本科牧草如狗尾草等混播，可建成良好的人工草地用于放牧。 

柱花草通常选择排水良好、土层深厚土质较好的沙壤或壤土种植。但在贫瘠土壤中，柱花草幼苗不能形成根瘤，或仅有一些由土著根瘤侵染形成的无效根瘤，在贫瘠的土地上豆科植物结种根瘤菌可增加产量15～50％。为提高柱花草结瘤率，固氮肥土，宜用柱花草根瘤菌拌种，可有效提高柱花草的结瘤率。因此筛选能使柱花草高效结瘤并达到高产的根瘤菌具有重要的意义。 

柱花草以其高产、优质及耐粗放管理的特性在引进后很快成为了我国南方豆科牧草的主推品种。在柱花草引进之初由于种植地土壤中柱花草土 著菌的含量极低，柱花草不能很好地结瘤固氮，主要依靠施肥获得高产。这样就不能体现出真正的高产和耐粗放管理。后来我国从澳大利亚引进了根瘤菌菌剂施用于柱花草种植地，对柱花草的产量有了一定的提高。但是由于澳大利亚的根瘤菌菌剂是基于澳大利亚的土壤和气候环境选出的高效菌株，到我国的气候和土壤环境只是能少量的提高柱花草产量，并不能达到澳大利亚那样的高产效果。目前我国还没筛选出适合于我国气候土壤条件的菌株，故从我国种植柱花草的不同类型土壤条件的土著菌中筛选适合于特定区域的柱花草高效固氮根瘤菌有重要的现实意义。 

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种根瘤固氮菌株系RY1，一种能使柱花草高效结瘤并达到高产的根瘤菌。 

本发明于2009年2月27于广西省百色市田阳农田荒地中(E10652.483N2347.971H146)采集到一株结瘤较大、生长茂盛的柱花草的根瘤，分离及纯化得到一种慢生根瘤菌株RY1(Bradyrhizobium sp.)，于2009年11月13日保藏于中国湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC NO：M 209265。其16sDNA序列如如SEQ ID NO 1所示。 

本发明的另一个目的是提供所述根瘤固氮菌株系RY1的培养方法。本发明将采集到的根瘤，剪掉柱花草地上部分将整个根系连同根瘤一起装入保鲜袋后置于冰袋中低温后续的保存备分离和纯化。具体的分离及纯化过程：从冰袋中取出柱花草的根系冲洗干净，转移到灭菌后的培养皿中，灭菌，将根瘤捣碎，蘸取乳白色汁液在准备好的YMA固体培养基上用逐步 稀释法划板。将划好的板倒置于保鲜袋中置于培养箱(26～30℃、黑暗)中培养。培养过程中注意检查培养基上是否有长出菌落，标记菌落，记录形态和光泽度，确定为根瘤菌。 

排除非根瘤菌菌落后根据上述标记的菌落将生长单菌落的时间相差3天以上的菌落及板上生长形态、菌落大小、菌落透明度、及灯光下的折射、菌落颜色不一致的菌落挑出，在新的固体YMA培养基上划板并编号。每一次对新划板的菌落都采用上述方法进行一次纯化直至同一块板上的菌落生长形态、菌落大小、菌落透明度、及灯光下的折射、菌落颜色一致为止。通过逐级纯化将纯化后的板进行镜检和回接后划入YMA斜面中保存。 

所述根瘤菌菌落形态：根瘤菌生长初期菌落水样的半透明或白色不透明点状物后期菌落为圆形、乳白色、半透明、边缘整齐、粘质或多或少。培养2～4天菌落直径达2～4mm为快生型根瘤菌，培养5～10天菌落才1mm的为慢生型根瘤菌。 

其菌体形态：根瘤菌为(0.5～0.9)×(1.2～0.3)μm的小杆菌。内常含β-羟基丁酸，即折射强的似空洞的颗粒或使菌体呈环节状，革兰氏阴性(G-)，无芽孢，菌体单个或成对。