[发明专利]基于猪瘟病毒NS3建立的间接ELISA方法

说明书

技术领域：

本发明属于兽医生物技术领域，是基于猪瘟病毒(Classical Swine FeverVirus CSFV)重组蛋白NS3为包被抗原，建立检测CSFV抗体的间接ELISA方法。

背景技术：

猪瘟(Classical Swine Fever CSF)是由CSFV引起的一种急性热性传染病，各种年龄阶段的猪都可感染发病，该病被国际动物卫生组织(OIE)列为A类传染病，我国将其列为一类传染病。虽然该病在北美洲、大洋洲及部分欧洲国家已经消灭，但在其他养猪国家仍广泛存在，并对养猪业造成严重危害。我国长期对猪群免疫接种猪瘟病毒兔化弱毒(Hog Cholera Lapizined Virus HCLV)疫苗，基本控制了猪瘟的大流行，但猪瘟在我国各地猪群中广泛存在，并呈现地区性散发性特点，在猪群中存在一定隐性感染和持续性感染现象。

当前CSF实验室诊断方法主要存在的问题之一是如何有效地区分CSFV野毒株和疫苗毒株的感染，虽然有报道特异性RT-PCR能够区分病毒野毒和疫苗毒感染，但其对技术性要求过高，不适合大规模的流行病学调查。酶联免疫吸附试验(ELISA)具有操作简单、敏感性高、快速、易标准化等优点，适合于大规模血清学检测。但当前研制开发的绝大部分CSFV抗体检测试剂盒，包括广泛用于CSFV-Ab血清学检测的IDEXX公司CSFV-Ab检测试剂盒，同样不能区分CSFV野毒株和疫苗毒株的感染产生的抗体。随着基因工程疫苗技术的发展，现已研究开发出以CSFV E2作为抗原的基因工程标记疫苗，和基于CSFV E^rns的鉴别诊断ELISA。虽然CSFV E2基因工程疫苗能够对易感猪群提供保护，但在实际临床中以E^rns为抗原建立的鉴别诊断ELISA在血清学检测方面存在敏感性低的缺陷(75～80％)，导致CSFV基因工程标记疫苗在实际临床应用中受到限制。上述问题存在导致开展CSFV净化工作受到严重阻碍，使得我国猪群中CSFV长期存在并对养猪业造成巨大危害。

发明内容：

本发明所要解决的技术问题是：针对上述现有技术的不足，提供一种基于猪瘟病毒NS3建立的间接ELISA方法，可用于猪群中CSFV NS3蛋白抗体检测，以此判断猪群中CSFV NS3抗体水平、猪群中CSF自然感染的情况，以及为CSFV E2基因工程标记疫苗提供鉴别诊断ELISA。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种基于猪瘟病毒NS3建立的间接ELISA方法，该方法包括如下步骤：

(1)、包被抗原的制备：

根据GenBank中猪瘟病毒全基因序列(登录号：AF351433)，设计两条引物，上游引物fP：5′-GATGAGCTCGGGCCTGCCGTTTGCAAGAAG-3′，下游引物rP：5′-TCTCCTCGAGTTATAGA CCAACTACCTGTTTTAGTGC-3′，通过PCR方法从猪瘟病毒兔化弱毒(HCLV)cDNA中扩增到长度为2049bp NS3基因序列，将其克隆到原核表达载体pET-32a(+)(购自Novagen公司，产品编号：69015-3)中，构建重组原核表达载体pETNS3；将重组原核表达载体pETNS3转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)细胞，经0.1mM IPTG诱导高效表达了重组蛋白NS3，该蛋白主要以包含体形式表达，部分为可溶性表达，采用Ni⁺亲和层析方法(参照Novagen公司High-Affinity Ni-NTA Resin试剂盒说明书)纯化得到重组蛋白NS3，制得抗原。对照孔包被的抗原硫氧还蛋白由pET-32a(+)空质粒转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)细胞诱导表达，采用Ni⁺亲和层析方法进行纯化。

(2)、以纯化的重组蛋白NS3作为包被抗原建立间接ELISA：

①包被：用pH为9.6的0.05M碳酸盐缓冲液稀释包被抗原包被96孔ELISA板(美国Costa公司)，检测孔NS3蛋白包被量为200ng/孔，对照孔包被硫氧还蛋白40ng/孔，4℃条件下包被24小时后甩干，采用PBST(0.05M PH7.4PBS+0.05％吐温-20，下同)洗涤2遍；

②封闭：封闭采用PBST稀释5％脱脂奶粉，300μl/孔，37℃条件下封闭2h后甩干，用PBST洗涤3次；