[发明专利]用于定量检测K-ras突变的试剂盒

说明书

发明背景

K-ras基因属于ras癌基因家族，因其编码21kD的ras蛋白又名p21基因。K-ras基因是EGFR信号通路的重要分子之一，其编码产物处在EGFR通路的下游，在肿瘤细胞的生长、增殖、血管生成等过程中起着重要的“开关”作用。发生突变时，K-ras蛋白处于持续活性状态，失去对细胞生长的正常调控，可导致细胞持续生长、阻止细胞凋亡。不同肿瘤组织中K-ras基因突变率不同，其中胰腺癌82％，结肠癌43％，肺癌30％，甲状腺癌29％，膀胱、肝、肾和子宫癌10％或低于10％(BosJ.L.et al，Cancer Res，1989，49(17)：4682-4689)。由于突变K-ras的持续激活与EGFR活性是否被抑制无关，使得患者不能从抗EGFR治疗中获益(Amado R.G.et al，J.Clin.Oncol.，2008，26(10)：1626-1634；Lièvre A.et al，J.Clin.Oncol.，2008；26(3)：374-379)。因此通过对K-ras基因的突变检测，可以对抗EGFR药物的治疗效果做出一定的前瞻性评估，实现肿瘤病人的个体化治疗，从而达到良好的预后。

目前K-ras基因突变点主要集中于第12、13位氨基酸密码子(张健杰等，西安交通大学学报，2005，26(4)：349-351；何晓文等，中华消化杂志，2002，22(1)：26-28)，其中12密码子GGT碱基突变为GTT或GAT碱基为最常见的突变类型。本发明通过实时定量PCR方法检测分子靶向抗肿瘤药疗效相关的肿瘤相关基因K-ras 12、13密码子5种类型的突变情况，来预测爱必妥等分子靶向药物的治疗效果。

本发明采用的检测方法具有以下几个优点：操作简单，易于标准化。其它方法如等位基因特异的寡核苷酸探针杂交法，对杂交的条件非常敏感，需要严格控制实验条件；限制性片段长度多态性实验需投入相当的人力操作，且不能定量。实验周期短，2小时内就可以完成。不需要测序验证结果，而直接测序法与高分辨溶解曲线分析需要4天-2周。敏感度高，我们通过对实验条件进行优化，突变检测的敏感度可达到1％，而直接测序法敏感度20-50％。特异性高，免疫组化方法假阳性与假阴性率高，且不能确定点突变的位置和类型；定量准确，这是本发明实验方法最独特的优点，通过绝对定量法处理数据，从而绘制标准曲线，精确测定样本中野生型与突变型基因的含量，进而得到突变型基因所占比例，辅助临床诊断和用药。另外，本发明安全无毒性，其它方法如错配碱基的化学断裂法需要用到同位素和剧毒化学试剂。

发明内容

本发明要解决的问题是提供一种K-ras基因突变的定量检测试剂盒。定量检测K-ras基因12密码子(SEQ ID NO：1；SEQ ID NO：2)2155位GGT碱基突变为GTT、AGT、GAT或TGT碱基；13密码子(SEQ IDNO：1；SEQ ID NO：2)GGC碱基突变为GAC碱基的情况。

为解决上述问题，本发明提供包含Taq酶、10×Taq缓冲液、MgCl₂、dNTP混合液及可特异性扩增K-ras基因突变位点序列的PCR引物与可特异性识别野生型与突变型序列的探针的定量检测试剂盒及检测方法：

(1)分别在K-ras基因12、13密码子突变位点附近设计上下游引物，以及根据每个突变位点的突变情况设计特异性的探针，该探针可与K-ras特定位点的野生型或欲检测的突变型序列特异性结合，从而确定该位点有无发生所检测的基因突变。

(2)为精确定量所测K-ras突变比例，本发明设计了标准品。

(3)对待测样品与标准品进行荧光定量PCR检测。

(4)由标准品检测结果得到用于定量的标准曲线，由标准曲线计算得到待测样品核酸的K-ras基因突变占总体K-ras基因的比例。

所述步骤(1)之前还包括：对待测样品中的核酸进行提取、纯化和浓度测定。