[发明专利]测定食品中盐酸林可霉素含量的酶联免疫吸附分析方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种测定食品中盐酸林可霉素(LIN)含量的酶联免疫吸附分析方法(ELISA)，属于食品安全监督或食品分析的研究领域。

背景技术

盐酸林可霉素(LIN)，俗称洁霉素或林肯霉素，属于林可胺类抗生素，是由美国人Mason等首先从链霉菌林可变种培养液中获得的一种高效广谱抗生素，对革兰阳性球菌有较好作用。除了临床主要用于敏感菌引起的各种感染外，其在动物饲养及动物疾病治疗中也被广泛使用，并能作为肉鸡的生长促进剂。虽然盐酸林可霉素毒性不大，但对人畜仍具有潜在危害性，如会造成假膜性肠炎的发生及细菌耐药性，其在动物组织中的残留问题日渐受到重视。因此各国政府及相关组织都对盐酸林可霉素作出限量要求，我国农业部235号文件规定其在牛奶，肝脏中的残留量分别为150μg/L，500μg/kg，美国食品药品监督管理局规定其在牛奶及猪，鸡的可食用组织中的残留限量为150μg/L，100μg/kg。

检测盐酸林可霉素的方法主要是高效液相色谱法(HPLC)，但是由于其在200-220nm处仅有较弱的紫外吸收，用紫外检测器无法达到低含量检测的要求。气相色谱法(GC)往往需要衍生化，增加了操作的繁琐性且灵敏度也不高。近年来，液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)用于盐酸林可霉素的检测，虽然灵敏度较高，但仪器昂贵，前处理复杂及需要专业人员操作等因素也局限了其在现场检验，样品筛选中的应用。

酶联免疫吸附分析法(ELISA)具有灵敏度高、特异性强、分析快速的优点，常被用于临床、药物、食品和环境等分析领域。本发明的目的是在采用一种新颖的半抗原修饰方法基础上，建立灵敏度高、特异性强的的测定盐酸林可霉素的酶免疫分析方法。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足而提供一种测定食品中盐酸林可霉素含量的酶联免疫吸附分析方法，其特点是以多克隆抗体和抗原与之间特异性反应为基础而建立的分析方法。

本发明的目的由以下技术措施实现，其中所述原料份数除特殊说明外均为重量份数。

测定食品中盐酸林可霉素含量的酶联免疫吸附分析方法。

(1)盐酸林可霉素修饰物的制备

步骤1：将3～5g盐酸林可霉素(LIN)与5～8mL对甲氧基苯甲醛溶于15～20mLN，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，以苯作为带水剂，在106℃下反应，在苯不断被蒸走后得到粗产物，再经过NaHCO₃中和，二氯甲烷萃取，活性碳脱色以及乙醚-正己烷结晶后得到第一步产物2.5g，用红外光谱(IR)确证产物的分子结构。

步骤2：将0.5～0.8g步骤1产物、1～2mL三乙胺和1.5～1.8g三苯氯甲烷溶解在5～8mL丙酮中，以CaCl₂为干燥剂回流反应24小时，将反应液冷却到50℃，加入0.5～1.5g硅胶，混合物搅拌10分钟，用丙酮热过滤，滤液用环己烷-正己烷结晶得到粗产物，粗产物溶于丙酮中快速经过硅胶柱，收集流出液，加热回流，用50～70mL 55℃的水重结晶得到略黄有光泽的固体颗粒，IR确证产物的分子结构。

步骤3：将步骤2产物0.2～0.5g和0.1～0.18g丁二酸酐溶于10～20mL新蒸吡啶中，在氮气保护下，室温反应24小时，45℃真空旋干得到黄色油状物，溶于乙酸乙酯中，依次用0.001mol/L HCL及纯水洗涤。加入无水NaSO₄干燥过夜，真空旋干得白色固体，IR确证产物的分子结构。

步骤4：步骤3产物0.1～0.18g加入3～5mL80％乙酸溶液中，在90～100℃加热回流20～30分钟，充分冷却，析出白色固体，过滤，滤液真空旋干得油状物，用苯反复洗涤，旋干得到最终产物，IR确证产物的分子结构。

步骤1-4的反应如下：

(2)免疫原和包被抗原的制备

将30～50mg盐酸林可霉素衍生物，15～18mg二环己基碳二亚胺(DCC)，8～10mgN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，溶解于400～600μL的DMF中，室温搅拌过夜，将混合物离心5～20分钟，取上层清液，缓慢加入0.01～0.02％的牛血清白蛋白(BSA)或卵清蛋白(OVA)，搅拌反应24小时，离心分离，取上层清液，透析数天，获得林可霉素-蛋白质溶液，冷冻干燥，于温度-20℃保存待用。其中，LIN-OVA为免疫原，LIN-BSA为包被抗原。

(3)盐酸林可霉素多克隆抗体的制备