[发明专利]奶牛乳汁孕酮检测试剂盒

权利要求书

1.奶牛乳汁孕酮检测试剂盒，其特征在于：通过抗原-抗体反应，将抗体、抗原或酶标抗原固定于固相酶标板上，建立板式直接竞争ELISA法。

2.根据权利要求1所述的奶牛乳汁孕酮检测试剂盒，其特征在于：所述的板式抗孕酮单克隆抗体包被酶标板，辣根过氧化物酶标记孕酮抗原。

3.根据权利要求1或2所述的奶牛乳汁孕酮检测试剂盒，其特征在于：用板式直接竞争ELISA法定量检测奶牛乳汁孕酮。

4.根据权利要求1或2所述的奶牛乳汁孕酮检测试剂盒，其特征在于：制备方法是板式之际竞争ELISA法的制备方法，第一，抗孕酮单克隆抗体固相酶标板制备：抗孕酮单克隆抗体腹水采用辛酸-硫酸铵法和HiTrap Protein G HP层析柱纯化，用0.01mmol/LPBS1∶8000稀释抗体包被酶标板4℃过夜，并用1％酪蛋白封闭，后置于30℃干燥箱处理，处理后置于4℃待用。第二，酶标记孕酮抗原的制备：(1)称取11α-羟孕酮半琥珀酸酯2.6mg，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)0.9mg和二环己基羰二亚胺(DCC)1.3mg置5mL三角烧杯中，滴加0.15mL二甲基甲酰胺(DMF)，混匀后于4℃过夜；(2)次日可发现有尿素衍生物结晶析出，说明已有孕酮衍生物的N-羟基琥珀酰亚胺活化酯形成；(3)取辣根过氧化物酶(HRP)2mg，用2mL0.1MNaHCO₃液溶解，室温搅拌下加活化酯2uL，以后每10秒2uL，共加10uL。室温下继续搅拌8h，然后应用0.04MpH7.2的PBS1000mL搅拌透析24h，期间换液三次。初步透析的偶联物上SephadexG-25柱(GE)，用PBS洗脱，流速为1滴/6s。加稳定剂在-20℃保存。第三，标准品的制备：以5.0g活性炭和0.5g葡聚糖(G25)溶于250mL不含BSA的测定缓冲液，磁力搅拌器搅拌30min，成为用葡聚糖包被的活性炭(DCC)，弃上清取沉淀，加入50mL奶牛乳样，磁力搅拌器搅拌30min，置冰箱中过夜，2000rpm离心1h，取上清液同法再离心一次，收集上清即为去激素率98％的脱激素乳。

5.根据权利要求3所述的奶牛乳汁孕酮检测试剂盒，其特征在于：试剂盒的使用方法：(1)将试剂盒取出，将各种试剂恢复到室温；(2)洗涤：用洗涤液洗涤酶标板，3min/次，洗2次；(3)标准品配制：用标准品稀释液稀释标准品成8个浓度(40ng/mL、20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL、1.25ng/mL、0.625ng/mL、0ng/mL)；(4)加样：将稀释后的标准品和待测乳样各100uL，分别加入100uL酶标孕酮工作液混匀后加入各孔，100uL/孔，并做重复孔。置于37℃反应50min；(5)洗涤：同2，洗3次；(6)显色：加入显色剂(由显色B液对显色A液100倍稀释)100，室温避光15min；(7)终止：加入终止液50uL/孔；(8)酶标仪测定OD_450nm值。其中B0是无孕酮抑制时0ng/mL的OD值，B为各个孕酮浓度抑制时的40ng/mL、20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL、1.25ng/mL、0.625ng/mL OD值，代入公式Logit(B/B₀)＝Ln[(B/B₀)/(1-B/B₀)]，以Lg[P]为横坐标，Logit(B/B₀)为纵坐标绘制标准曲线，利用Microsoft Excel拟合曲线方程。将所得B/B₀值代入曲线方程求出乳汁样品中的孕酮含量。试剂盒的最低检测限为0.14ng/mL。