[发明专利]猪用干扰素-胸腺肽广谱抗病毒药物制剂及制备方法

说明书

技术领域

本发明提供一种猪用新型广谱抗病毒生物制剂，本发明还提供了该生物制剂的合成方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

干扰素(IFN)是细胞分泌的小肽，具有抗病毒，抗增生和免疫调节等广泛的生物学活性。研究表明，干扰素在动物中是普遍存在的，不仅人和高等动物的细胞能够产生干扰素，甚至许多低等动物和细菌也能产生干扰素。干扰素诱生剂或病毒均可诱导动物机体或动物细胞产生干扰素。已研究的所有哺乳动物中，都含有IFN-α，IFN-β(I型)和IFN-γ(II型)基因。其中IFN-β和IFN-γ具有种属特异性，而IFN-α具有异种动物的抗病毒活性。正常细胞一般不自发产生干扰素，只存在合成干扰素的潜能，IFN基因处于被抑制状态。在有诱发剂的条件下，IFN基因解除抑制而获得表达。

胸腺中包含多种激素，归属于α、β、γ三类，共同诱导T细胞的成熟分化。胸腺肽主要活性成份是由28个氨基酸组成的胸腺肽α1(THYα1)，现已有化学合成的商品。近年来，由于胸腺肽在多种抗病毒免疫中的高效、低毒等特性，其应用也日趋广泛。

目前国内兽医临床上干扰素和胸腺肽应用很少，尤其二者融合蛋白的表达及其应用的研究至今尚无报道。

发明内容

本发明公开了猪用干扰素-胸腺肽广谱抗病毒药物制剂及制备方法，适用于工业化生产。

本发明这种猪用新型广谱抗病毒生物制剂的合成方法如下：

依据IFN-α1和THY-α1的分子结构特征及大肠杆菌密码子的偏爱性设计引物，采用PCR方法获得二者的融合基因。将该基因克隆至pGEX4T-2原核表达载体中，构建了pGEX4T-IFNα1-THYα1原核表达质粒。将重组质粒转化至BL21(DE3)受体菌中，经IPTG诱导、表达、纯化获得IFNα1-THYα1融合蛋白。通过细胞病变抑制实验和E玫瑰花环形成实验对蛋白进行生物活性检测。

上述引物序列如下：

IF1：5’-cgcggatcctgtgacctgcctcagac-3’(BamHI)；

IF2：5’-ccggaattccaggtttctggaggaaga-3’(EcoRI)

IT1：5’-atccaccgccgcatccgagccggctgcagcgcccaggtttctgga-3’；

IT2：5’-ttttagatctttggtggttatttccgacgaggtatccaccgccgcatc-3’；

IT3：5’-ccgctcgagtcaattttcggcttcttccaccacttcttttttttcttttagatctttggt-3’；

IT4：5’-ccgctcgagtcaattttcggcttcttc-3’(XhoI)

本发明这种猪用新型广谱抗病毒生物制剂的合成方法，包括以下步骤：

1、猪干扰素α1与胸腺肽α融合基因原核表达载体的构建

(1)从猪全血基因组中扩增干扰素α1基因；

(2)人工合成猪胸腺肽α1基因；

(3)通过linker(连接肽)将猪干扰素α1基因和胸腺肽α1基因连接起来形成融合基因；

(4)将融合基因克隆至pGEX 4T-2表达载体中，构建重组质粒；

(5)采用PCR、限制性酶酶切、序列测定等方法鉴定重组质粒。

2、融合蛋白的表达、纯化及活性分析

(1)将重组质粒转化至E.coli BL21宿主细胞感受态菌中，筛选阳性克隆菌；

(2)蛋白的诱导表达及鉴定；

(3)目的蛋白分离纯化；

(4)目的蛋白活性检测。

以下实验表明IFNα1-THYα1融合蛋白具有两种生物活性：

融合蛋白的生物活性检测：

1、细胞病变抑制实验：

IFN-α1可以使细胞建立抗病毒状态，使细胞免受病毒攻击的损害，据此可以判断融合蛋白是否具有干扰素的抗病毒活性。实验方法如下：

1.1猪肾上皮细胞PK15的复苏

(1)将培养液置于37℃水槽水浴加热，之后用70％酒精擦拭，移入无菌操作台内。

(2)自液氮罐中取出冷冻管，立即放入37℃水浴中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1min内全部融化，以70％酒精擦拭冷冻管外部，移入无菌操作台内。

(3)取出0.9mL解冻之细胞悬浮液，缓缓加入有培养液的细胞瓶内(稀释比例为1∶10-1∶15)，混合均匀，放入CO2培养箱培养。

(4)解冻后，1000rpm离心5min，弃去上清，加入新鲜培养液，混合均匀，放入CO2培养箱培养。