[发明专利]利用转录因子转染牛体细胞成为诱导性多能干细胞的方法

权利要求书

1.一种利用转录因子转染牛体细胞成为诱导性多能干细胞的方法，包 括如下步骤：

1)牛皮肤成纤维细胞的分离与培养

以成年牛皮肤成纤维细胞BDF和新生牛皮肤成纤维细胞NDF，经常规培 养后分别获得大量的成年牛皮肤成纤维细胞和新生牛皮肤成纤维细胞；

2)牛维持多能性转录因子基因的克隆及其逆转录病毒载体的构建

从50-60日龄牛胎儿中分离生殖嵴，提取总RNA，经过逆转录反应得到 cDNA；以cDNA为模板，经过PCR反应得到牛Oct4、Sox2、c-Myc与Klf4 四个基因扩增产物并经测序验证序列正确而后将目的基因插入到逆转录病毒 载体pMSCVneo中，构建这4种基因的逆转录病毒表达载体；

3)逆转录病毒的包装与准备

PT67包装细胞按照常规方法培养在DMEM培养基中，待细胞达到 70％-80％汇合时，应用脂质体将逆转录病毒转染进入包装细胞PT67细胞，进 行病毒包装以获得具有感染性逆转录病毒颗粒；转染前1小时，DMEM培养 基换成无血清培养液，4-8μg逆转录病毒质粒DNA和10-20μl脂质体分别加 入到500μl Opti-MEM-I+GlutaMAX-I优化转染液中，轻柔混匀，室温孵育， 然后将稀释的质粒DNA和脂质体轻柔混匀，再室温孵育20分钟后，将混合 液逐滴加入PT67细胞培养皿中；细胞在37℃，5％CO₂和饱和湿度条件下培 养4-6h后，转染液换成新的含15％FBS的DMEM培养液；经过24小时转染 后，收集PT67细胞培养液上清，该上清中就包含感染性逆转录病毒颗粒；上 清液经过0.45μm孔径的滤膜过滤，每24小时收集一次，连续收集3d；病毒 悬浮液在4℃条件下，经过25,000转/分，离心90分钟，10倍浓缩病毒上清液， 将Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4四种基因病毒上清液进行等量混合，并添加8 μg/ml polybrene组成特定的四因子基因组合，-80℃保存，准备转染牛皮肤成 纤维细胞；

4)逆转录病毒感染牛皮肤成纤维细胞以及牛的iPS细胞的获得

将成年牛皮肤成纤维细胞BDFs和新生公牛皮肤成纤维细胞NDFs按照常 规方法培养在60mm塑料培养皿中，待培养皿中细胞生长到70-80％融合时将 包含Oct4、Sox2、c-Myc与Klf4基因转录因子的逆转录病毒上清液的混合 液分别加入到成纤维细胞BDFs与NDFs培养皿中感染成纤维细胞；细胞长满 培养皿后按1∶3常规传代，视细胞生长情况在第6-10d将细胞以1×10⁵细胞 /孔的密度，转移至预先铺有人羊膜(HAM)6孔培养板上，作为饲养层培养 感染后的牛细胞，同时培养液更换成干细胞培养液；培养孔内每天半量换液， 连续观察20-28d，直到有细胞集落出现为止，记为0代，即为牛iPSCs；

所述的干细胞培养液的组成为：每100ml溶液中含有：82.69ml的 knockout-DMEM、15ml FBS、1ml浓度为200mM谷氨酰胺、1ml浓度为10 mM非必需氨基酸、200μl浓度为55mM β-巯基乙醇、10μl浓度为400ng/ml 人重组碱性成纤维生长因子、100μl浓度为105U/mL白血病抑制因子。