[发明专利]鉴定矿化刺激因子的基质蛋白单克隆抗体及鉴定方法

权利要求书

1.一种鉴定矿化刺激因子的基质蛋白单克隆抗体，其特征在于，专一性识别合浦珠母贝基质蛋白。

2.一种利用权利要求1所述基质蛋白单克隆抗体鉴定与矿化相关的基质蛋白刺激因子的方法，其特征在于，该鉴定方法具体按以下步骤进行：

步骤1：取合浦珠母贝的外套膜细胞，利用普通培养基采用组织块法原代培养2天～4天，然后，根据需鉴定的刺激因子的种类，将不同刺激因子分别加入该培养基中，再培养2天～4天，得到含有外套膜分泌的基质蛋白的培养基；

步骤2：取BALB/c小鼠进行4次免疫，将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞融合，然后，采用酶联免疫吸附试验的方法筛选出阳性杂交瘤细胞，将该阳性杂交瘤细胞进行克隆，并筛选出特异性识别基质蛋白的单克隆杂交瘤细胞，将该单克隆杂交瘤细胞注射到正常BALB/c小鼠体内，获取该小鼠的腹水，将该腹水亲和纯化获得单克隆抗体；

步骤3：取新西兰兔，用基质蛋白进行4次免疫，取得基质蛋白多克隆抗体；

步骤4：分别取20mM碳酸钠缓冲液和步骤3取得的基质蛋白多克隆抗体，用碳酸钠缓冲液对该基质蛋白多克隆抗体进行稀释，制成浓度为2μg/ml～10μg/ml、pH值为9.2～9.4的多克隆抗体稀释液，然后，分别取该多克隆抗体稀释液和96孔酶标板，在该96孔酶标板的每孔中分别加入100μl～150μl多克隆抗体稀释液，置于4℃的温度条件下，孵育1小时～2小时，将孵育后的96孔酶标板用磷酸缓冲液洗涤4次；

步骤5：按重量比，分别取羊血清3％～5％、牛血清白蛋白3％～5％和纯水90％～94％，混合形成封闭液，各组份总量100％；

步骤6：分别取步骤4洗涤后的96孔酶标板和步骤5制得的封闭液，在96孔酶标板每孔中分别加入100μl～150μl封闭液，然后，在37℃的温度下，封闭1小时～2小时；

步骤7：分别取普通培养基、步骤1得到的含有外套膜分泌的基质蛋白的培养基和步骤6封闭完成的96孔酶标板，将普通培养基和含有外套膜分泌的基质蛋白的培养基各250μl分别加入96孔酶标板的孔内，每个样品设4个平行对照，然后，在37℃的条件下，孵育小时～2小时，之后，用磷酸缓冲液将基质蛋白与多克隆抗体结合后的96孔酶标板洗涤4次；

步骤8：分别取碳酸钠缓冲液和步骤2制得的单克隆抗体，将该单克隆抗体用20mM碳酸钠缓冲液稀释，制成浓度为2μg/ml～10μg/ml、pH值为9.2～9.4的单克隆抗体稀释液，将该单克隆抗体稀释液加入步骤7洗涤后的96孔酶标板孔内，控制96孔酶标板每孔内分别加入100μg单克隆抗体稀释液，之后，将加入单克隆抗体稀释液的96孔酶标板置于37℃的温度下，孵育1小时～2小时，然后，将单克隆抗体与基质蛋白结合后的96孔酶标板用磷酸缓冲液洗涤4次；

步骤9：按体积比1∶1500，分别取辣根过氧化物酶标记亲合素和辣根过氧化物酶标记亲合素稀释液，对辣根过氧化物酶标记亲合素进行稀释，得到辣根过氧化物酶标记亲合素稀释溶液；

步骤10：分别取步骤9制得的辣根过氧化物酶标记亲合素稀释溶液和步骤8洗涤后的96孔酶标板，在该96孔酶标板每孔内分别加入150μl辣根过氧化物酶标记亲合素稀释溶液，然后，置于37℃的温度下孵育1小时～2小时，之后，将孵育后的96孔酶标板用磷酸缓冲液洗涤4次；

步骤11：分别取邻苯二胺和pH值为5.0的柠檬酸缓冲液，按10ml柠檬酸缓冲液中加入10mg邻苯二胺的比例，将邻苯二胺加入柠檬酸缓冲液中，混合均匀，得到混合液，在该混合液使用前，按每10ml该混合液中加入18μl双氧水的比例，将双氧水加入混合液中，制得邻苯二胺底物溶液；

步骤12：分别取步骤11制得的邻苯二胺底物溶液和步骤10洗涤后的96孔酶标板，在该96孔酶标板每孔中分别加入150μl邻苯二胺底物溶液，进行避光显色，显色10分钟～30分钟后，在96孔酶标板每孔中分别加入浓度1M的H₂SO₄溶液30μl，终止反应，然后，采用酶标仪在490nm波长下测定吸光度；

步骤13：根据步骤12中测得的490nm波长下的吸光度，通过对比加入刺激因子的培养基和空白对照组培养基的吸光度值，比较基质蛋白浓度变化，鉴定该刺激因子是否促进基质蛋白的分泌。

3.按照权利要求2所述的鉴定方法，其特征在于，所述步骤4中采用Costar公司生产的96孔酶标板。