[发明专利]组织工程产品的低温保存液及其使用方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医学材料组织工程技术领域，具体涉及一种组织工程产品的低温保存方法。 

背景技术

组织工程产品是由细胞和三维支架构建的人造组织或器官，如体外构建的组织工程皮肤就是应用组织工程学方法，将种子细胞与支架材料结合构建的功能性皮肤替代物，再将其种植于创面，在支架材料逐渐降解吸收的过程中，使细胞正常生长、分化并形成具有一定功能的组织，达到替代、修复、再生受损组织或器官的目的。组织工程的最终目标是实现规模产业化，因此组织工程产品的长期保存是不可或缺的重要环节。 

由于组织工程产品含有活细胞，因此在保存时选用低温冻存法较为适宜。低温冻存是一种完全抑制细胞能量代谢，使之处于休眠状态从而长期保存的方法。按降温速率分类，低温冻存通常分为慢速降温和快速降温二类。 

快速降温法是以易形成玻璃化态的低温保存液为介质，利用快速降温的方法(通常为直接浸入液氮)保存细胞或组织。玻璃化冻存保存液主要由易于形成玻璃化态的渗透性试剂(通常采用乙二醇、二甲基亚砜、甘油、甲酰胺等)和使细胞脱水的非渗透性试剂(通常采用低分子量的果糖、乳糖、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、海藻糖、密三糖，和高分子量的聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚乙烯醇、羟乙基淀粉等)组成。通常玻璃化低温保存液的试剂浓 度非常高，总浓度通常达到50％以上。 

采用二甲基亚砜、去离子甲酰胺和丙二醇配制的玻璃化低温保存液在冻存大鼠的软骨时，可以达到80％的冻存效率(Song YC，Lightfoot FG，Chen Z，Taylor MJ，Brockbank KGM.Vitreous preservation of rabbit articularcartilage.Cell Preserv Technol 2004；2：67-74.)。由于组织工程法构建的组织不同于天然组织，所采用的种子细胞是在体外培养后再与支架复合，因此细胞的状态、活性通常不如天然组织中的细胞，这就导致该类细胞对冷冻过程中的损伤(由胞内外冰晶造成)更加敏感，而且高浓度的渗透性试剂本身对细胞活性就有较大影响。如利用上述冻存大鼠软骨的方法对组织工程血管(牛胶原复合大鼠动脉平滑肌细胞)进行低温冻存，复苏后的细胞活性只有39％(Elder E，Chen Z，Ensley A，Nerem R，Brockbank K，Song Y.Enhancedtissue strength in cryopreserved，collagen-based blood vesselconstructs.Transplant Proc 2005；37(10)：4625-46299.)。另外，有研究表明，在室温条件下，把组织工程真皮浸泡在含30％二甲基亚砜的玻璃化低温保存液中10分钟，细胞活性便降低了10％(Xin Wang，Tse-Chao Hua，Da-WenSun，Baolin Liu，Guanghui Yang，Yilin Cao.Cryopreservation oftissue-engineered dermal replacement in Me2SO：Toxicity study andeffects of concentration and cooling rates on cell viability.Cryobiology 2007；55：60-65)。再则，快速降温的玻璃化低温保存液试剂的高浓度，导致细胞脱水量非常大，在组织复苏时，需按梯度法逐渐稀释，否者极易导致细胞死亡，给临床应用带来极大的不便；且因高浓度试剂极易在组织中残留，对应用于人体的组织工程产品则具有潜在危险。