[发明专利]一种基于双抗体识别的血清中MG7-Ag的定量检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及血清中MG7-Ag的检测方法，特别涉及一种基于双抗体识别的血清中MG7-Ag的定量检测方法。

背景技术

恶性肿瘤是当前严重影响人类健康、威胁人类生命的主要疾病之一。恶性肿瘤的研究及应用方向已从以治疗为主转向防治结合。肿瘤的早期诊断尤为重要，它决定了肿瘤治疗的成败。胃癌是我国常见重大恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率均在继续上升。目前用于胃癌早期筛查最可靠的途径是内窥镜检查结合活体组织病理检查。但是，对于少数夹杂在正常组织细胞中的形态不典型胃癌细胞、分化差或未分化的胃癌细胞、发生淋巴结转移的胃癌肿瘤鉴别难度很大；而肿瘤标志物的检查是一种很有效的方法。

肿瘤标志物(Cancer biomarker)的发现和应用是一个系统的方法，从高危人群的筛查、早期癌症的检出，到诊断及定位、机体对治疗的反应及预后观察，直至癌症复发的检测，肿瘤标志物发挥了重要的作用。目前临床常用的胃癌的肿瘤标志物有CEA、CA19-9、CA72-4等，受CEA、CA19-9和CA72-4标志物特异性的限制，能够检测到以上标志物的绝大多数患者，其病情已进入中晚期。

樊代明等人最新发现了一种胃癌特异性抗原MG7-Ag(Lee CH，Lum JH，Fan DM et al.Proteomics.2005；5(4)：1160-1166)，并针对该抗原制备了鼠源性单克隆抗体MG7(Fan DM，Zhang XY，Chen XT et al.Journal of Gastroener-ology and Hepatology.2005；20(3)：360-365)。在组织学研究中发现，MG7-Ag在胃癌中阳性率达90％以上，在正常胃粘膜中不表达。MG7-Ag表达量在萎缩性胃炎、异型增生及胃癌组织中呈渐进递增，同时对MG7-Ag阳性的萎缩性胃炎及异型增生患者随访，其转癌率显著增高(Liu J，Hu JL，FanDM et al.Int J Clin Pract.2002；56(3)：169-172)。国家973项目(G1998051203)通过严格“双盲”前瞻回顾性研究证实，胃粘膜上皮肠化生、异型增生呈MG7-Ag阳性表达者与阴性表达者相比较，病变进展危险性增加25～40多倍，提示MG7-Ag与胃癌发生发展和分化有良好的相关性，对于检测胃癌的高危个体有重要的应用价值。

现有对于MG7-Ag的定量检测主要是通过酶联免疫(ELISA)方法，其中包括包被抗原、抗原抗体反应、二抗反应、显色、读板等步骤。由于血清中MG7-Ag属于微量抗原，含量很小，酶联免疫测定方法敏感度仅达ng水平，精度不高，容易出现误差，无法实现准确定量。

实时荧光定量PCR技术出现于1996年，该技术的核心是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累，实时监测整个PCR进程，通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在PCR反应早期，产生荧光的水平不能与背景明显地区别；而后荧光的产生进入指数扩增期，荧光水平随之呈指数增长；最后在PCR到达平台期时荧光水平达到饱和，且由于PCR技术是指数扩大系统，微小误差的指数放大使终产物量存在较大的离散度。而实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统PCR只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度。设定检测点荧光值在指数扩增阶段为荧光阈值，当荧光信号强度到达所设定的荧光阈值时，自动记录荧光信号达到荧光阈值所经历的循环数(Ct值)。

已经证实，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。因此利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线对未知样本进行定量测定。由于PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期，此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到Ct值是恒定的。基于以上两大特点，实时荧光定量PCR是一种采用外标准曲线定量的方法。