[发明专利]高通量可目视化人乳头瘤病毒基因芯片快速分型检测方法

权利要求书

1.高通量可目视化人乳头瘤病毒基因芯片快速分型检测方法，该方法用于 非疾病诊断目的；其特征在于：该方法的实现步骤包括：

(1)制备芯片

(1.1)设计检测探针

根据人乳头瘤病毒的13种亚型设计检测探针，从左至右为5’-3’，探针序 列如下：

检测探针的5’端均采用NH₂-C6修饰；

(1.2)芯片点制

先进行片基表面醛基化修饰处理，然后将检测探针按照设计好的阵列固定 在片基上，再进行芯片点样后处理，得寡核苷酸芯片；

(2)待检测样本的处理

(2.1)引物的选用

选用人乳头瘤病毒病原对应的引物，即通用引物GP5和GP6，序列如下：

GP5---5’-TTT GTT ACT GTG GTA GAT ACT AC-3’

GP6---5’-GAA AAA TAA ACT GTA AAT CAT ATT C-3’

(2.2)制备不对称PCR扩增产物

用引物对待检样本进行不对称PCR，生成不对称PCR扩增产物，该产物是 与固定在芯片上的检测探针特异性互补的单链DNA产物；

(3)胶体金标记经修饰的捕获探针

(3.1)设计合成捕获探针

以通用引物GP6的互补链作为捕获探针，该探针的序列如下：

5′-GAA TAT GAT TTA CAG TTT ATT TTT CTT TTT TTT TT-3′

在该捕获探针的3′端做SH-C₆修饰；

(3.2)用胶体金标记经SH-C₆修饰的捕获探针；

(4)芯片杂交

取不对称PCR扩增产物和经胶体金标记的捕获探针置于芯片表面，放置杂 交盒内进行杂交反应，反应完毕后清洗芯片；

(5)银染显色

取银显影液均匀涂布在芯片杂交区域上，避光反应后，去除多余的显影液， 室温离心甩干后肉眼观察，或用平面扫描仪对玻片进行信号扫描，利用软件进 行数据分析。

2.根据权利要求1所述的高通量可目视化人乳头瘤病毒基因芯片快速分型 检测方法，其特征在于：(3.2)捕获探针的胶体金标记，其具体实现方法是：

(3.2.1)将经SH-C₆修饰的捕获探针1OD溶解在1ml双蒸水中，取30ul加入 1ml胶体金，使浓度为4nm，室温放置16小时；

(3.2.2)加入500ul0.3M NaCl，10mM PBS，再放置40小时，离心，弃上 清，深红色沉淀用0.1M NaCl和pH7.0，10mM的PBS溶液洗涤，去除未标记的寡 核苷酸；

(3.2.3)洗涤后的深红色沉淀经14000rpm离心30min，然后用0.3M NaCl和 pH7.0，10mM的PBS1ml重悬，4℃放置备用。

3.根据权利要求1所述的高通量可目视化人乳头瘤病毒基因芯片快速分型 检测方法，其特征在于：步骤(4)芯片杂交的具体实现方法是：将不对称PCR 扩增产物，杂交液和胶体金标记的捕获探针以1∶8∶1的体积比混合，取混合样 品加在芯片表面置杂交盒内52℃杂交45min；取出芯片，立即浸入洗液中清洗， 最后常温下将芯片离心甩干；所述杂交液是pH7.0，0.3M的PBS；洗液是pH7.0， 1.2M的PBN，PBN成分是0.3M NaNO₃和pH7.0，10mM的PBS。

4.根据权利要求1或2或3所述的高通量可目视化人乳头瘤病毒基因芯片快 速分型检测方法，其特征在于：所述胶体金的粒径为10±2nm，最大吸收峰在 520nm处。