[发明专利]重组创伤弧菌铁摄取调节蛋白及制备方法

说明书

技术领域：

本发明属于生物基因工程技术领域，尤其涉及一种操作简便、成本低廉、重组蛋白纯度好、得率高、适应于工业化生产的重组创伤弧菌铁摄取调节蛋白及制备方法。

背景技术：

创伤弧菌是一种嗜盐性革兰氏阴性细菌，生存于海洋和河口环境中，易引起海洋动物(如海水鱼、虾、贝)伤口感染、胃肠炎和败血症等，是主要的病原弧菌之一，给海水养殖业带来巨大的经济损失。弧菌的生长及致病与很多微量元素有关，铁是维持弧菌新陈代谢所必需的营养物质之一，对病原菌的复制增殖是必需的，所以弧菌在缺铁的环境中不能生长，但是如果摄取过量也会因形成羟基而引起细胞毒作用和氧化应激，从而停止生长。存在于弧菌中的铁摄取调节蛋白(Fur)可作为阻遏蛋白与二价铁形成稳定的复合物，该复合物与铁调控基因上游长度19bp的操纵子序列结合，从而达到抑制转录减低细胞内铁浓度的目的，同时抑制铁吸收系统许多编码基因及其铁调节基因的表达。研究铁摄取调节蛋白在弧菌代谢过程中的作用，有助于深入了解弧菌的致病机制，从而可有效地控制弧菌病的流行。然而，从创伤弧菌中直接提取该蛋白的操作复杂、成本高、产量少，不能大规模产业化生产且所得蛋白容易降解，因此人们致力于重组制备创伤弧菌铁摄取调节蛋白。

现有技术已有关于对弧菌铁摄取调节蛋白(Fur)表达的报道(钱荣华，于涟，毛芝娟，等。溶藻弧菌铁调蛋白基因的克隆、表达及其特征分析。科技通报，2007，23：651-657)，是通过将溶藻弧菌铁摄取调节蛋白基因与pET-30a(+)表达载体重组获得表达质粒来表达Fur蛋白的。但是，此方法在表达过程中产生了包涵体，所以在纯化前要对样品进行变性和复性，不仅操作复杂，增加制备成本，也容易使蛋白结构遭到破坏。

发明内容：

本发明是为了克服现有技术所存在的上述技术问题，提供一种操作简便、成本低廉、重组蛋白纯度好、得率高、适应于产业化生产的重组创伤弧菌铁摄取调节蛋白及制备方法。

本发明的技术解决方案是：一种重组创伤弧菌铁摄取调节蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：4。

一种上述重组创伤弧菌铁摄取调节蛋白的制备方法，其特征在于按如下步骤进行：

a.培养创伤弧菌菌种并提取DNA；

b.设计创伤弧菌铁摄取调节蛋白编码序列的引物对，以上述提取的创伤弧菌DNA为模板进行PCR扩增；

c.PCR电泳回收产物与克隆载体pMD19T连接并转化入大肠杆菌感受态细胞DH5α，在含氨苄青霉素的LB固体培养基上培养通过蓝白斑法筛选阳性克隆，选择450bp大小的条带进行回收；

d.用限制性内切酶EcoR I和Xho I分别双酶切c步骤回收产物和表达载体pET-32a(+)，将得到的两种目的基因片断用DNA连接酶连接，转化入大肠杆菌感受态细胞DH5α进行培养并筛选提取重组表达质粒；

e.将所提取的重组表达质粒转化入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)内，培养菌株得菌液，用IPTG诱导菌液，收集菌种；

f.将所收集的菌种进行扩大培养，收集菌体；

g.将菌体破碎、裂解、纯化，收集纯化液。

所述引物对的核苷酸序列为：

上游引物VuF：5’-CCGGAATTCATGTCAGACAATAACCAAGC-3’；

下游引物VuR：5’-CCCTCGAGGTTCTTACGTTTATGTGCG-3’。

所述PCR反应条件为：94℃预变性5分钟后进行94℃变性30秒、56.2℃复性30秒、72℃延伸30秒的30个循环的扩增，72℃延伸7分钟后保存于4℃。

所述e步骤是将所提取的重组质粒转化入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)后，挑取单菌落接种于5ml Amp LB液体培养基过夜培养，再取50μl过夜培养的菌液接种5ml Amp LB液体培养基，37℃、200转/分摇菌2.5小时，至菌液的OD600为0.4，向菌液中加诱导剂IPTG至终浓度为1mM，37℃摇菌4小时后，回收菌体。

所述g步骤是用PBS重悬f步骤所得菌体，用超声波破碎细菌并用孔径为0.22μm的过滤器过滤细菌裂解液，在4ml Bind buffer中加1ml 50％的Ni-NTA HisBind树脂悬液，轻轻混匀，静置，待树脂沉淀后取沉淀；在沉淀中加4ml细菌裂解液，轻轻混匀后用振荡器4℃，200rpm振荡1～2h形成混合液；将混合液移入纯化柱，用0.5ml Elute buffer洗脱，收集洗脱液。