[发明专利]glmM基因敲除菌株、制备方法、筛选结核分枝杆菌磷酸葡糖胺变位酶抑制剂的用途及方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种用于筛选抗结核药物的菌株，尤其是一种glmM基因敲除菌株、制备方法、筛选结核分枝杆菌磷酸葡糖胺变位酶抑制剂的用途及方法。 

背景技术：

结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)是引起结核病(tuberculosis)的病原菌，据WHO报道^[1]，目前全球有近1/3的人已感染结核分枝杆菌，每年新发结核病人约9000万。由于多耐药(multi drug resistant，MDR)菌株及广泛耐药(extensive drug resistant，XDR)菌株的出现，现有一些一线及二线抗结核药物都无法有效地治愈结核病^[2]，导致每年约有200万人死亡，结核病已成为全世界成人因传染病而死亡的主要疾病之一。 

目前，新药研制已由过去大多数随机、偶然和被动的药物发现过程变为主动的以明确靶标为依据的新药开发过程，以细菌代谢途径中的酶或蛋白质作为靶标来筛选先导化合物，是目前研发新的抗生素的一种策略^[3，4]。研究表明，分枝杆菌与革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌相比，具有特殊的细胞壁结构，其核心结构由分枝菌酸、聚阿拉伯半乳糖及肽聚糖三种大分子所构成^[4，5，6]。分枝菌酸由含70-90碳原子的脂类分子组成，形成致密的低通透性外层，肽聚糖位于细胞壁的最内层并与细胞质膜相连。分枝菌酸与中层的聚阿拉伯糖(由呋喃型阿拉伯糖残基聚合而成)及聚半乳糖(由呋喃型半乳糖残基聚合而成)连接后再通过衔接二糖(L-鼠李糖-N-乙酰葡糖胺，L-Rhamnose-N-GlcNAc)共价连接到肽聚糖大分子上。因此，衔接二糖是维持分枝杆菌细胞壁完整性的重要结构。N-乙酰葡糖胺既是衔接二糖的组成成分，又是肽聚糖的组成成分，其糖基供体为UDP-N-乙酰葡糖胺。UDP-N-乙酰葡糖胺的生物合成途径包括由三种酶所催化的四步反应^[4]，其中磷酸葡糖胺变位酶催化第二步反应，使葡糖胺-6-磷酸转变为葡糖胺-1-磷酸。 

由此可见，磷酸葡糖胺变位酶是N-乙酰葡糖胺赖以存在的必要条件，亦是维持分枝杆菌细胞壁完整性的关键。但是，迄今为止还没有以磷酸葡糖胺变位 酶为抗结核药物的作用靶标，从已有组合化合物库及中药中筛选出有效的磷酸葡糖胺变位酶抑制剂的相关报道。 

发明内容：

本发明是以参与结核分枝杆菌细胞壁中关键组分生物合成的磷酸葡糖胺变位酶为对象，提供一种glmM基因敲除菌株、制备方法、筛选结核分枝杆菌磷酸葡糖胺变位酶抑制剂的用途及方法。 

本发明的技术解决方案是：一种glmM基因敲除菌株，属于分枝杆菌属耻垢分枝杆菌种，拉丁文学名Mycobacterium smegmatis，菌株代码ML2009，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，菌种保藏代号：CGMCC 3418，菌种保藏日期：2009-11-06。 

一种上述glmM基因敲除菌株的制备方法，其特征在于按如下步骤进行： 

a.用分子克隆技术从耻垢分枝杆菌基因组中克隆Msm glmM基因并插入卡那霉素抗性(kan^R)基因，使Msm glmM基因突变以产生突变基因ΔglmM； 

b.通过DNA同源重组，使突变基因ΔglmM整合到耻垢分枝杆菌基因组中，产生同时携带正常基因Msm glmM及突变基因ΔglmM的菌株ML1； 

c.用分子克隆技术从结核分枝杆菌基因组中克隆Mtb glmM基因，并构建pCG-Mtb glmM表达载体； 

d.将pCG-Mtb glmM表达载体转化到ML1菌株中，当Mtb glmM基因能够补偿ML1菌株中ΔglmM突变基因的功能时，通过DNA同源重组方式将ML1菌株基因组中的正常基因Msm glmM删除，产生耻垢分枝杆菌glmM基因敲除菌株ML2009。 

一种上述glmM基因敲除菌株在筛选结核分枝杆菌磷酸葡糖胺变位酶抑制剂中的用途。 

一种上述用glmM基因敲除菌株筛选结核分枝杆菌磷酸葡糖胺变位酶抑制剂的方法，其特征在于按如下步骤进行： 

e.将glmM基因敲除菌株ML2009按1∶2000稀释接种到含有被筛选物的LB液体培养基中，被筛选物的浓度为2～20ug/ml，在30℃条件下，每间隔24小时，用酶标仪测定菌株ML2009在600nm处的光吸收值；