[发明专利]一种耐热耐碱木聚糖酶重组工程菌BL21-XA及其应用

说明书

技术领域

本发明属于酶基因工程和酶工程领域，更具体涉及一种耐热耐碱木聚糖酶重组工程菌BL21-XA及其应用。

背景技术

木聚糖酶是一类可以催化分解半纤维、木聚糖、支链木寡糖的水解酶类。它们不同于一般的酶类，它是一种内切酶系，对底物具有很好的转糖基和降解作用。近年来随着人们对于该酶应用范围认识的增强，此类酶得到了一定的研究。然而由于生产中使用木聚糖酶常需要有一定的高温条件和较高的耐碱性，因此耐热嗜碱木聚糖酶的选育具有极大潜能的应用价值；但是现有技术中理想的制备耐热耐碱木聚糖酶用的重组工程菌比较缺乏。

发明内容

本发明的目的是解决现有技术中对于制备耐热耐碱木聚糖酶用的重组工程菌比较缺乏的问题，提供一种耐热耐碱木聚糖酶重组工程菌BL21-XA及其应用，由该工程菌BL21-XA制备的热稳定木聚糖酶具有很好的活性、耐受性好、pH值适应性宽，耐热耐碱性等性能。

本发明的含有土芽孢杆菌属(Gebacillus sp.)嗜热菌TC-W7的高温木聚糖酶基因的重组质粒pXA：所述重组质粒的核苷酸序列的碱基序列为：如SEQ NO.1中所述。

本发明的耐热耐碱木聚糖酶重组工程菌BL21-XA：所述重组工程菌BL21-XA中含有上述的高温木聚糖酶基因的重组质粒pXA。

本发明的耐热耐碱木聚糖酶重组工程菌BL21-XA，用大肠杆菌为宿主细胞得到大肠埃希氏重组工程菌[Escherichia coli BL21-XA]，该菌株已于2009年7月22日由中国典型培养物保藏中心收到登记入册，并于2009年7月25日由该保藏中心检测完毕为存活，其保藏号为：CCTCC：M209164。

本发明的耐热耐碱木聚糖酶重组工程菌BL21-XA构建为：温泉样品经木聚糖平板分离、纯化，得到酶活较大的菌株TC-W7。经16SrDNA鉴定为Gebacillus sp.TC-W7。从土芽孢杆菌属(Gebacillus sp.)嗜热菌TC-W7中采用常规或采用基因组提取试剂盒提取其总DNA；以所提取的嗜热菌Gebacillus sp.TC-W7总DNA为模板，采用木聚糖酶酶基因简并引物进行PCR扩增，获得1200bp的DNA片段，测序验证。采用基因工程工具酶，将扩增的DNA片段连接到质粒载体pGEX中；然后用连接产物转入大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)感受态细胞，均匀涂布在LB平板上，所述LB平板含Amp 100μg/ml；挑取阳性重组工程菌菌落，提取质粒；随后采用双酶切和测序的方法鉴定该木聚糖酶的DNA片段已正确融入了表达载体。

本发明的热稳定木聚糖酶含有如SEQ NO.1中所述的DNA的碱基序列。

本发明的热稳定木聚糖酶为具有SEQ NO.2氨基酸序列的蛋白质，或者热稳定木聚糖酶也可以是将序列SEQ NO.2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸取代、缺失或添加，并且具有序列SEQ NO.2的相同活性的由序列SEQ NO.2衍尘的蛋白质。

本发明的热稳定木聚糖酶的制备步骤包括：

1、土芽孢杆菌属(Gebacillus sp.)嗜热菌TC-W7的分离鉴定：将所采集的样品涂布木聚糖平板后，挑取单菌落进行划线纯化，将纯化后的菌株点种透明圈观察平板上，选取有透明圈产生的菌株进行复筛，从而得到酶活较大的菌株TC-W7。对该菌株进行菌落形态，菌株形态的观察，革兰氏属性以及16SrDNA的鉴定，命名为Gebacillus sp.TC-W7。

2、热稳定木聚糖酶酶基因的克隆：从土芽孢杆菌属(Gebacillus sp.)嗜热菌TC-W7中采用常规或采用基因组提取试剂盒提取其总DNA；以所提取的嗜热菌Gebacillus sp.TC-W7总DNA为模板，采用木聚糖酶酶基因简并引物进行PCR扩增，获得1200bp的DNA片段，测序验证。

3、热稳定木聚糖酶重组工程菌的构建：采用基因工程工具酶，将扩增的DNA片段连接到质粒载体pGEX中；然后用连接产物转入大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)感受态细胞，均匀涂布在LB平板上，所述LB平板含Amp 100μg/ml；挑取阳性重组工程菌菌落，提取质粒；随后采用双酶切和测序的方法鉴定该木聚糖酶的DNA片段已正确融入了表达载体；

4、重组工程菌按微生物发酵和酶工程技术制备热稳定木聚糖酶。

本发明的热稳定木聚糖酶可以用于生物质能源、食品、造纸或医药卫生等领域，对木聚糖具有降解、糖基转化的作用。