[发明专利]一种4-磷酸赤鲜糖的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术应用领域，具体地说，涉及一种利用分子生物学技术制备4-磷酸赤鲜糖的方法。

背景技术

葡萄糖氧化分解的一种方式是磷酸戊糖(ppp)代谢途径。由于此途径是由6-磷酸葡萄糖(G-6-P)开始的，因此又被称为己糖磷酸旁路。此途径是在细胞的胞浆中进行的，整个代谢途径经过氧化阶段和非氧化阶段的一系列酶促反应，同时产生NADPH+H⁺，提供还原力。具体的说，第一阶段由G-6-P脱氢生成6-磷酸葡糖酸内酯开始，然后水解生成6-磷酸葡糖酸，再脱氢脱羧生成5-磷酸核酮糖；第二阶段是5-磷酸核酮糖经过一系列转酮反应及转醛反应，再经过磷酸丁糖、磷酸戊糖及磷酸庚糖等中间代谢物，最后生成3-磷酸甘油醛及6-磷酸果糖，后二者与糖酵解相衔接，还可重新进入糖酵解途径而进行代谢。

4-磷酸赤鲜糖是生物体内代谢的重要中间产物，赤鲜糖-4-磷酸(E4P)和磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)可以合成莽草酸，是合成芳香族氨基酸(色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸)的前体物质，也可合成与植物生长、抗病性有关的生长素、木质素、绿原酸、咖啡酸等，植物在感病或受伤情况下，该途径明显加强；同时还是合成维生素B6等一些药物和活性中间体的前体物质。因此，4-磷酸赤鲜糖作为代谢的中间产物合成上述物质对生物体来讲具有重要的生理作用。

目前制备4-磷酸赤藓糖的方法主要有：1、过氧化氢氧化阿拉伯糖酸钙制备；2、四乙酸铅氧化D-葡萄糖制备；3、高碘盐酸氧化4，6-O-亚已基-D-葡萄糖制备。以上方法均需要在高温高压条件下进行，对反应设备要求高，产物成分复杂，并且得率低。

因此，有必要提出一种新的4-磷酸赤鲜糖的制备方法。

发明内容

本发明为了克服目前合成4-磷酸赤鲜糖方法的缺点，利用分子生物学技术，制备耐高温、特异性转化4-磷酸赤鲜糖的转酮醇酶，通过固定化酶技术，以6-磷酸果糖和3-磷酸甘油醛为原料高效制备4-磷酸赤鲜糖，方法简单实用。

一种4-磷酸赤鲜糖的制备方法，在55-65℃下，固定化耐热的转酮醇酶，以6-磷酸果糖和3-磷酸甘油醛为原料通过酶促反应制备4-磷酸赤鲜糖。

合成4-磷酸赤鲜糖的酶促反应如下：

本发明的方法，其中所述固定化转酮醇酶的方法优选采用重组工程菌表达C-端带有6个组氨酸标签的转酮醇酶(6×His-TK)，然后使用Ni-NTA蛋白纯化树脂层析柱特异性吸附6×His-TK，洗去杂蛋白，Ni-NTA蛋白纯化树脂层析柱保留TK，在有底物6-磷酸果糖和3-磷酸甘油醛情况下，生成4-磷酸赤鲜糖。

本发明的方法，其中所述转酮醇酶能耐受55-65℃的温度。可以来源于皮炎组织胞浆菌(Ajellomyces dermatitidis)、紫球硫菌(Thiosphaerion violaceum)、红栖热菌(Thermus ruber)或白色嗜热单孢菌(Thermomonospora alba)。

本发明的方法，转酮醇酶优选来源于皮炎组织胞浆菌(Ajellomyces dermatitidis)，具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。利用多聚酶链反应扩增皮炎组织胞浆菌的TK基因，然后把该基因片段插入到载体pET中，构建大肠杆菌表达载体，转化E.coli JM109后制备TK。用于扩增TK基因的正向引物和反向引物如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。表达产物为C-端带有6个组氨酸标签的皮炎组织胞浆菌转酮醇酶。

上述技术方案具有以下优点：

1、利用来源自皮炎组织胞浆菌等的转酮醇酶能够耐受高温，特异性生成4-磷酸赤鲜糖的特性，通过基因克隆，发酵表达，并结合Ni-NTA蛋白纯化树脂纯化带有6个组氨酸标签的转酮醇酶，同时制备耐高温的固定化酶装置，以6-磷酸果糖和3-磷酸甘油醛为原料高效制备4-磷酸赤鲜糖。

2、利用带有6个组氨酸标签的转酮醇酶能与Ni-NTA蛋白纯化树脂层析柱特异性结合的原理，再用含有低浓度的咪唑洗去杂蛋白，保留在Ni-NTA层析柱上的6×His-TK，从而简化6×His-TK分离纯化步骤。