[发明专利]人黑色素瘤高转移模型、细胞亚系以及建立方法和转移的动态检测

说明书

技术领域

本发明涉及一种人黑色素瘤高转移模型、细胞亚系以及建立方法和转移的动态检测，属于动物模型和动物细胞系的技术领域。

背景技术

肿瘤的侵袭与转移时恶性肿瘤最基本的生物学特性之一，原发性肿瘤致死是较为罕见的，90％以上肿瘤患者的死于肿瘤细胞在人体内的转移时。

人黑色素瘤是危害头颈部的主要疾病之一，成为最常见的恶性肿瘤。然而目前肿瘤转移的确切机制尚不十分清楚，关于肿瘤转移一直是肿瘤学研究的热点。所以在本领域的研究中较大的局限性，制约了对人黑色素瘤转移机制的研究的进展。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种人黑色素瘤高转移模型、细胞亚系以及建立方法和转移的动态检测，以解决现有技术所存在的诸多不足之处。

用肺转移灶(人恶性黑色素瘤细胞株A375小鼠肺转移)在SCID小鼠用体内筛选的方法建立了皮下移植小鼠高转移模型及相应的细胞株，而且存在血路和淋巴两个转移途径；提出用深度免疫缺陷动物进行高转移模型的体内筛选，而在裸小鼠体内表达和应用的实验思路，并获得证实。

Alu顺序具有种属特异性，是人类基因组共有的序列且只为灵长类所特有。人Alu顺序探针只能用于检测人基因组中的Alu序列。利用PCR方法可以在脏器中检测常规病理学检查无法发现的微转移的肿瘤细胞。我们用BNX小鼠进行人黑色素瘤皮下移植，并检测了相关脏器的Alu基因表达，由于移植的瘤组织块完全来源于人黑色素瘤所以保证了实验的可靠性、特异性和灵敏性。

应用PCR方法检测Alu基因方法简单、灵敏度高、特异性强，可用于人体肿瘤动物异种移植模型中检测脏器转移特别是微转移，是一种值得推广的方法，有必要深入探讨。

本发明所需要解决的技术问题，可以通过以下技术方案来实现：

一种人黑色素瘤高转移模型，其特征在于，用人恶性黑色素瘤细胞株A375(2000年9月从中国科学院上海生命科学院细胞库获取，细胞编号TCHu 4，由上海市肿瘤研究所按常规方法长期保存和传代)进行SCID小鼠皮下移植，取肺转移灶移植至SCID小鼠皮下扩增。

一种人黑色素瘤高转移模型的建立方法，包括以下步骤。

(1)利用人恶性黑色素瘤细胞株A375进行SCID小鼠皮下移植，取肺转移灶移植至SCID小鼠皮下扩增；

(2)SCID小鼠体内综合筛选；选取深度免疫缺陷的SCID小鼠进行肿瘤高转移的体内筛选，等肿瘤长至直径1-2cm大小时，进行皮下移植传代，待动物出现明显恶性病质时，取肺可疑灶重复上述过程；第四代起按转移肿瘤组织→皮下移植→肺转移的体内筛选方式直接传代。

(3)进行试验检测，验证细胞特征。

其中步骤(2)所述皮下转移方法是将肿瘤组织切成2mm³大小，用穿刺针移植至SCID小鼠右侧腋窝皮下，每次筛选传代5-20只SCID小鼠不等，雌雄兼用，5-8周龄，饲养和实验严格按照SPF要求。

其中步骤(2)潜伏期从筛选初期的7-14天逐渐缩短至5天左右，荷瘤寿命从60-75天下降并稳定在45天左右。

其中步骤(2)皮下100％成瘤；肺转移率1至5代分别16.7％(1/6)、60％(3/5)、50％(4/8)、70％(14/20)和88.9％(16/18)，从第6代起肺转移率保持在100％；体表淋巴结转移第5代观察SCID小鼠皮下移植的同测腋窝淋巴结转移，用该动物的肺转移灶继续体内筛选，第6代至20代的186只动物中的147只发生淋巴结转移(转移率79.0％)，筛选第18代Scid小鼠，腋窝淋巴结肿大，直径约1.2×1.2cm。

其中步骤(3)中所述试验包括：病理组织学检查、免疫组织化观察、流式细胞分析。

所述病理组织学检查，光镜下筛选的皮下移植瘤巢团状弥散分布。肺脏的肿瘤细胞弥散状及腺样排列，充斥在肺脏边缘，肺泡间隔及支气管周围，细胞排列的形态、大小及分布各不相同，细胞分化差、核大、分裂相多见。每代均能见到肺血管内有散在或成团的肿瘤细胞。

所述免疫组织化观察：筛选的肿瘤组织免疫组化结果TGF-betal(转换生长因子-betal)阳性，Intergrin beta5阴性，CD31阳性，nm23(nm蛋白)阴性。

所述流式细胞分析：G2-M+S期(增殖期)细胞分别为39.38％±3.27和53.17％±16.1，细胞自然调亡为20.70％±11.51和11.90％±6.93，体内筛选后的人黑色素瘤模型和非转移模型相比，肿瘤细胞生长旺盛，调亡减少。