[发明专利]二鼠李糖脂人工抗原、抗体的制备和基于该抗体的酶联免疫试纸及其制备、检测方法

权利要求书

1.一种基于二鼠李糖脂多克隆抗体的酶联免疫试纸，其特征在于，所述酶联免疫试纸是 以硝酸纤维素膜为载体，所述载体上设有一个以上的加样孔，每个加样孔中附着有0.24～0.5μg 的二鼠李糖脂人工抗原，所述加样孔周围的蛋白质结合位点附着有牛血清蛋白；

所述二鼠李糖脂人工抗原的制备方法包括以下步骤：以二鼠李糖脂为半抗原，以牛血清 蛋白为人工抗原载体，利用碳化二亚胺法将所述二鼠李糖脂与牛血清蛋白进行交联，所述碳 化二亚胺、二鼠李糖脂和牛血清蛋白的质量比为1∶(5～7)∶(15～20)，交联完成后制得二 鼠李糖脂人工抗原。

2.根据权利要求1所述的基于二鼠李糖脂多克隆抗体的酶联免疫试纸，其特征在于，所 述二鼠李糖脂人工抗原的制备方法具体包括以下步骤：将所述5～7质量份的二鼠李糖脂、1 质量份的碳化二亚胺溶解于N，N-二甲基甲酰胺和磷酸盐缓冲液的混合液中，超声混合，然后 将溶解有15～20质量份牛血清蛋白的磷酸盐缓冲液添加到所述超声混合后的溶液中，在无光 条件下进行搅拌，搅拌过程中通惰性气体保护，然后静置，再将静置后的溶液与生理盐水混 合并反复进行透析，最后冷冻干燥得到二鼠李糖脂人工抗原。

3.一种如权利要求1或2所述的酶联免疫试纸的制备方法，包括以下步骤：以硝酸纤维 素膜为载体，在所述载体上压印加样孔，用空白样本稀释液浸泡所述载体后干燥，然后在单 个加样孔中滴加3～5μL浓度为80～100mg·L^-1的二鼠李糖脂人工抗原溶液，再于35℃～40℃ 下干燥10～30min，完成二鼠李糖脂人工抗原的固定，再用牛血清蛋白溶液封闭所述载体上剩 余的蛋白质结合位点，洗涤、干燥后制得酶联免疫试纸。

4.根据权利要求3所述的酶联免疫试纸的制备方法，其特征在于，用牛血清蛋白溶液封 闭所述载体上剩余的蛋白质结合位点是指：将固定有二鼠李糖脂人工抗原后的载体浸泡于质 量浓度为1％～2％的牛血清蛋白溶液中，于35℃～40℃下孵育1～2h，完成封闭。

5.一种如权利要求1所述的酶联免疫试纸的检测方法，包括以下步骤：将不同浓度的二 鼠李糖脂样本稀释液分别与含有二鼠李糖脂多克隆抗体的抗血清混合预培育，将预培育后的 混合液滴加到所述酶联免疫试纸的加样孔中，加样孔中固定的二鼠李糖脂人工抗原、待测二 鼠李糖脂样本稀释液中的二鼠李糖脂和所述二鼠李糖脂多克隆抗体之间进行竞争免疫反应， 反应完成后洗涤，酶联显色，根据所述酶联免疫试纸上斑点颜色深浅与所述二鼠李糖脂样本 稀释液浓度的负相关特性，确定出二鼠李糖脂样本稀释液中的二鼠李糖脂浓度大小；

所述二鼠李糖脂多克隆抗体的制备方法包括以下步骤：将所述二鼠李糖脂人工抗原乳化， 再免疫动物，然后利用免疫扩散方法测定该动物抗血清的效价，当效价达到1∶16以上的稀 释倍数值时采血，分离抗血清，得到二鼠李糖脂多克隆抗体。

6.根据权利要求5所述的酶联免疫试纸的检测方法，其特征在于，所述抗血清是指按 1∶(500～600)的稀释度稀释后的抗血清，所述抗血清与二鼠李糖脂样本稀释液是等体积混 合，所述混合预培育的时间为40～60min；所述酶联显色是指：将洗涤后的酶联免疫试纸浸泡 于按1∶(800～1000)稀释度稀释后的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔免疫球蛋白G溶液中， 35℃～40℃温度下孵育20～30min，漂洗干净后再将所述酶联免疫试纸置于新鲜配制的显色剂 中，室温下避光10～15min，再用蒸馏水漂洗，自然干燥，完成酶联显色。

7.根据权利要求5或6所述的酶联免疫试纸的检测方法，其特征在于，所述酶联免疫试 纸的单个加样孔中，混合液的滴加量为3μL～5μL，所述竞争免疫反应的时间为40～60min， 竞争免疫反应的温度为35℃～40℃。