[发明专利]抑制人AP-2alpha基因表达的siRNA及其抗乳腺癌用途

说明书

技术领域

本发明涉及一种siRNA，特别是涉及一种抑制人AP-2alpha基因表达的siRNA及其在抗乳腺癌药物制备中的应用。

背景技术

随着经济发展，人民生活水平的提高，在整个全球乳腺癌病人的死亡率逐年升高，居癌症死亡中第五位。统计结果显示2005年有120万妇女发现乳腺癌，有50万妇女死于乳腺癌。乳腺癌作为一个普遍性疾病，七八个妇女中就有一个患乳腺癌，在女性恶性肿瘤发病率居第一位。因此，对乳腺癌进行基因治疗的研究具有非常重要的应用价值。

乳腺癌是一个受多基因网络调控的疾病。AP-2作为一个重要的转录因子家族，众多的研究表明AP-2在乳腺癌中起着重要的调控作用。其中AP-2alpha在细胞生长和肿瘤发生中起着重要的作用(Cancer Res，2004，64：631-638)。免疫组织化学结果表明乳腺癌病人中细胞核中AP-2表达量下降或迁移到细胞质中表达，这联系着疾病的发展和肿瘤恶化增加，那么这也提示乳腺癌疾病的风险性增加(Clin Cancer Res，2002，8：3487-3495)。AP-2alpha的功能一部分是通过与AP-2alpha下游基因启动子区域结合，促进其表达来实现。癌基因ErbB2已被广泛应用于诊断乳腺癌，它的低表达预示着病人存活率高，预后良好(EurJ Cancer，2004，40：1485-1495)。有研究表明AP-2alpha与癌基因ErbB2基因启动子结合，促进ErbB2基因的转录和蛋白表达(Oncogene，1996，13：1701-1707)。进一步实验表明AP-2alpha与ErbB2基因在部分乳腺癌样品中表达的正相关性，表明AP-2alpha通过调控ErbB2基因的表达在乳腺癌的发生发展中起作用(Int.J.Cancer，2007，120：2061-2067)。

近20年来，RNAi(RNA interference)在肿瘤机制研究中显示了强大的功能，作为新型肿瘤治疗策略也显示了光明的前景。RNAi是高度特异的在mRNA水平上的基因沉默机制，由内源性或外源性dsRNA(double-stranded RNA)诱发，在细胞内被切割成21-25nt干扰性小RNA(small interfering RNA)，siRNA介导识别并靶向切割同源性靶mRNA分子，从而导致该基因不表达。siRNA由于强有力的特异性RNA干扰作用，现已成为一种理想的细胞水平基因敲除手段。siRNA的出现在哺乳动物细胞中产生特异的基因表达抑制，使得siRNA为人类疾病的治疗开创了新的天地。因此如何获得一种特异性抑制人AP-2alpha基因表达的siRNA及其载体并将它们应用于抗乳腺癌药物中是目前亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的一是提供一种特异性抑制人AP-2alpha基因表达的siRNA；二是能产生上述siRNA的表达载体；三是上述siRNA或siRNA的表达载体在抗乳腺癌药物制备中的用途。

本发明提供的抑制人AP-2alpha基因表达的siRNA，其碱基序列及其作用部位如下：

正义链5’UUU CUC AAC CGA CAA CAU U 3’；

反义链5’AAU GUU GUC GGU UGA GAA A 3’；

作用于人AP-2alpha mRNA的第956-976位。

所述的siRNA，可以通过人工合成，该siRNA在3’有2-6个dT修饰或2-6个U修饰。

所述的siRNA的表达载体。

所述的siRNA在抗乳腺癌药物制备中的应用。

所述siRNA的表达载体在抗乳腺癌药物制备中的应用。

本发明以RNA干扰技术为基础，从GenBank获得人AP-2alpha基因的cDNA序列，根据siRNA靶序列选择的基本原则，针对AP-2alpha基因设计了21个核苷酸，在siRNA的3‘端添加两个脱氧核糖核苷酸(dTdT)呈单链悬挂结构，以增强此siRNA在体内和体外的稳定性，防止降解。本发明中所使用的siRNA由本发明人自己设计，委托上海吉玛公司通过化学法合成。

本发明所述的siRNA能高效特异性地抑制AP-2alpha基因的mRNA和蛋白水平的表达。而该siRNA也特异性地降低了转录因子AP-2alpha对癌基因ErbB2的转录和蛋白水平的激活，同时MTT分析表明AP-2alpha siRNA抑制了MDA MB 453乳腺癌细胞的增殖。软琼脂克隆形成实验结果也一致地显示AP-2alpha siRNA加入后乳腺癌细胞形成克隆的数目急剧下降。因此，本发明可能提供一种全新作用机制的抗乳腺癌治疗方式和药物。