[发明专利]一种基因重组解淀粉芽胞杆菌及菌剂制备方法

权利要求书

1.一种基因重组解淀粉芽孢杆菌，其特征在于，该基因重组解淀粉芽孢杆菌染色体上整合有透明颤菌血红蛋白基因vgb，其分类命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)XLV09-1，保藏编号：CCTCC M209299。

2.一种权利要求1所述基因重组解淀粉芽孢杆菌的构建方法，其特征在于，包括以下具体步骤：

(1)PCR扩增P₄₃启动子

提取枯草芽孢杆菌B.subtilis v168菌株的总DNA，根据GenBank中登录的登记号为No.K02174.1的B.subtilis P₄₃ fragment序列，设计引物P₄₃-F：CCCAAGCTTGATAGGTGGTATGTTTTCGCTTG，下划线为Hind III酶切位点；P₄₃-R：GGTTTGCTGGTCTAACATGTGTACATTCCTCTCTT，以B.subtilis菌株总DNA为模板，P₄₃-F/P₄₃-R为引物，扩增长为0.37kb的P₄₃启动子，反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性45sec，58℃退火30sec，72℃延伸30sec；30个循环；72℃延伸10min；

(2)PCR扩增透明颤菌血红蛋白基因vgb

根据GenBank中登录的登记号为No.M27061的透明颤菌血红蛋白基因序列，以质粒pRK404-VHb为模板，用vgb-F：AAGAGAGGAATGTACACATGTTAGACCAGCAAACC和vgb-R：CCCGAATTCTTATTCAACCGCTTGAGCG，下划线为EcoRI酶切位点，以质粒pRK404-VHb为模板，Vgb-F/Vgb-R为引物，扩增0.44kp的透明颤菌血红蛋白基因vgb；反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性45sec，58℃退火30sec，72℃延伸30sec，30个循环；72℃延伸10min；

(3)重叠延伸拼接P₄₃启动子和vgb

用PCR回收试剂盒回收两次PCR的产物，并两种回收产物为模板，以P₄₃-F/Vgb-R为引物，采用重叠延伸拼接的方法扩增0.81kb的融合基因，反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性45sec，58℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min；

(4)中间载体pMD-P43vgb的构建 

用PCR回收试剂盒回收重叠PCR产物，将回收产物连接pMD18-T载体，连接体系为2μl PCR产物，2.5μl Solution I，0.5μl pMD18-T载体，16℃连接过夜，连接产物全部用来转化E.coli Top10感受态细胞，次日挑选抗性斑划线，用菌落PCR初步筛选阳性转化子；然后将阳性转化子转接小摇瓶，37℃摇床培养过夜，提取质粒，提取质粒进行用Hind III/EcoRI双酶切鉴定转化子质粒，进一步确定转化子，将酶切鉴定正确的质粒pMD-P43vgb测序；

(5)基因重组整合载体pDGP43-vgb的构建

提取基因重组质粒pMD-P43vgb和整合载体pDG1730，将质粒pMD-P43vgb和整合载体pDG1730同时用Hind III/EcoR I双酶切，回收其目的片段，将两者连接形成质粒pDGP43-vgb，转化E.coli Top 10感受态细胞，Amp抗性筛选阳性转化子；转化子经快速裂解、菌落PCR和酶切鉴定，筛选正确的阳性转化子pDGP43-vgb；将酶切鉴定的质粒pDGP43-vgb送测序鉴定；

(6)基因基因重组解淀粉芽孢杆菌工程菌XLV09-1的构建

制备解淀粉芽孢杆菌感受态细胞；用Xho I将基因重组整合载体pDGP43-vgb线性化，切胶回收，随后100ng DNA加入200μl感受态中，孵育20min；加入LB和抗生素，培养90min，然后涂布壮观霉素抗性平板，37℃倒置培养12-16h；挑选抗性菌落，划线到另一个平板；从壮观霉素平板上挑取转化子，然后在另一平板上划线培养，同时挑取一部分菌株做模板进行菌落PCR，以确定vgb表达框是否真正整合到解淀粉芽孢杆菌FZB42的染色体上，PCR的三对引物分别为P₄₃-F/P₄₃-R、Vgb-F/Vgb-R和P₄₃-F/Vgb-R；然后，使用淀粉酶水解圈试验来验证目的基因是否正确整合到解淀粉芽孢杆菌的amyE基因位点将amyE基因阻断，具体操作如下：将PCR筛选出的阳性菌落点种到含2％淀粉的LB平板上，用原始菌株作为对照，倒置培养三天，然后在平板中加入碘液进行染色，看菌落周围是否出现了水解圈；筛选出没有水解圈的菌落，即为基因重组解淀粉芽孢杆菌XLV09-1。

3.一种基因重组解淀粉芽孢杆菌菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)、菌种活化 

将保藏于中国典型培养物保藏中心保藏编号为CCTCC M209299的基因重组解淀粉芽孢杆菌XLV09-1划线接种于固体种子培养基斜面上，接种前将装有培养基的扁瓶在121℃条件下灭菌30分钟，接种后在28～35℃条件下培养30～48h，配成孢子液，以5％的接种量用于种子罐接种；

(2)种子罐发酵

先将一级种子罐灭菌，装入培养基后再灭菌，冷却至30℃，将孢子液接入培养液中，通入无菌空气培养，可得一级种子罐发酵菌液；将二级种子罐在121℃下灭菌30min，装入培养基后再灭菌，冷却至30℃，将一级种子罐发酵液按5％～8％接种量接入二级种子罐，通入无菌空气和搅拌进行培养，可得二级种子罐发酵菌液；

(3)生产发酵罐培养

先将发酵罐灭菌，装入培养基后再灭菌，保压降温至25℃～30℃，按5％～8％的接种量将二级种子罐发酵液接入发酵罐中培养，通过无菌空气；

(4)浓缩

发酵罐中发酵结束后，将菌液通过超滤进行浓缩，补加增效添加剂，随后装瓶；

所述灭菌采用高压蒸汽灭菌，即在121℃，压力0.3-0.5kg/cm2条件下灭菌30min，发酵罐接种后，在28～35℃条件下培养36～48小时，通气量1～2Vols/vol/min，氧气含量30～40％；

种子罐培养液配方：牛肉膏0.3～0.8％，蛋白胨0.7～1.2％，葡萄糖0.1～0.6％，NaCl 0.1～0.6％，MgSO₄·7H₂O 0.01～0.06％，K₂HPO₄0.01％～0.06％，MnSO₄0.02％～0.08％，余为水，pH值消毒前7.0～7.8，消毒后pH6.8～7.5；

发酵罐培养基配方为：葡萄糖2～8％，L-谷氨酸钠0.3～1.5％，KH₂PO₄0.08～0.22％，K₂HPO₄0.10～2.2％，CaCO₃0.1～2.20％，FeSO₄·7H₂O 0.001～0.005％，余为水，pH值消毒前8.5～11.0，消毒后6.5～9.5；

发酵液要求：发酵液含活芽胞数每毫升达80亿以上，菌体量不足5％时放罐，pH值7.0-8.0，无杂菌污染；

所述百分比为重量百分比。