[发明专利]一种工程蝇凝集素的高效纯化方法

说明书

技术领域

本发明属于化学分离技术领域，涉及一种凝集素，尤其是一种工程蝇凝集素的高效纯化方法。

背景技术

凝集素有多种生物学活性，广泛用于医药、食品、保鲜等行业，凝集素对机体免疫有双重调节作用，能够促进机体对肿瘤细胞的识别与清除，凝集素单独作用于肿瘤细胞能够引起肿瘤细胞凋亡，对于病毒在体内复制也有很好的抑制作用，还能促进炎症后机体的恢复过程。从工程蝇体内提取的凝集素是一种糖蛋白，其生物活性功能与其分子量、分子结构、糖链的组分都有密切的关系，并使其具有特定的生物学功能，如抗肿瘤特性，对免疫应答、免疫低下、免疫疾病也有很好的调节作用。

目前工业上运用最为广泛凝集素是刀豆凝集素，但是由于提取得率低而且价格昂贵，如何高效提取凝集素组分是一亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种提取率高、方法简单的工程蝇凝集素的高效纯化方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种工程蝇凝集素的高效纯化方法，纯化的步骤是：

(1)对工程蝇的幼虫进行诱导，待幼虫化蛹后，收集蛹，除去饲养过程中混入的杂质，清水漂洗，收集漂洗干净的蛹，加提取溶剂研磨，3-5℃静置0.8-1.2h，得到浸提液备用；

(2)由步骤(1)得到的浸提液，离心，过滤除去杂质，重复离心、过滤步骤2-4次，收集过滤后的上清液，经过石油醚的抽提，得到的浓缩液备用；

(3)将步骤(2)得到的浓缩液在4-40℃条件下与胶混合，每30min缓慢搅拌一次，3.5-4.5h后装柱，缓冲液平衡，缓冲液洗脱流速控制在0.8-1.2mL/min，洗脱杂蛋白，之后进行糖溶液竞争性洗脱，竞争性洗脱液流速控制在0.5mL/min，收集洗脱峰；

(4)将收集到洗脱峰过Sephade×G200凝胶柱，先后检测到四个峰值，分别对各个峰的成分进行回收、冷冻、干燥，得到白色粉末即为凝集素。

而且，所述步骤(1)中幼虫化蛹的化蛹率为80％。

而且，所述步骤(1)的提取溶剂为生理盐水或者昆虫缓冲液BIS。

而且，所述步骤(3)中混胶使用的是Sepharose 4B。

而且，所述步骤(4)的缓冲液为昆虫缓冲液BIS。

而且，所述步骤(4)的竞争性洗脱液为：D-半乳糖溶液0.2-0.3moL/L。

本发明的优点和积极效果是：

1、本发明以工程蝇为原料，工程蝇凝集素具有糖结合专一性，其配基能与凝集素结合，适合采用特异性纯化，利用色谱分离技术对其进行提取、分离、纯化，并且工程蝇凝集素在40℃下稳定，适合室温提取，提取方法不仅简单而且实用，适合大规模工业生产。

2、本发明提取的工程蝇凝集素是一种具有不同的分子量、结合特异性的大分子物质，其分子量从68kD-22kD之间，由多种氨基酸组成，冻干后样品为白色粉末，易溶于水，难溶于有机溶剂，如乙醇、乙醚、甲醛等，保藏方便，再利用方便。

附图说明

图1为本发明工程蝇蛹提取液的亲和层析图；

图2为本发明电泳分析凝集素纯度及分子量非变性电泳，图中：M为标准蛋白质样品；I为经R-250染色的样品；

图3为本发明凝集素SDS-PAGE电泳图，M为标准蛋白质样品，I为加入β-巯基乙醇。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

一种工程蝇凝集素的高效纯化方法，其纯化的步骤是：

(1)利用工程蝇传代，得到性状稳定的子代，收集工程蝇子代的蛹，为提高子代繁殖率与性状稳定，要求饲养环境24℃-30℃，湿度控制在60％左右，室内饲养环境达到清洁级，饲料为高营养、高能量饲料。对工程蝇的幼虫进行诱导，待幼虫化蛹后(80％化蛹)，收集蛹，除去饲养过程中混入的杂质，用清水漂洗5次，收集漂洗干净的蛹，以昆虫缓冲液BIS或者生理盐水做为蛹糖蛋白的提取溶剂，加5倍蛹体积的BIS或者生理盐水进行研磨，4℃静置1h，得到浸提液备用；

注意：用生理盐水做为蛹糖蛋白提取溶剂时，温度应控制在4℃，此时能抑制蛹体内一些蛋白酶对糖蛋白的降解，以提高产物的得率。

(2)由步骤(1)得到的浸提液，先经过12000rpm离心15min，过滤除去几丁质、脂肪等杂质，重复离心、过滤步骤3次，收集过滤后的上清液，经过石油醚的抽提，得到的浓缩液备用；