[发明专利]嵌套式PCR扩增桔小实蝇rDNA中ITS间断序列的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物DNA技术，特别涉及一种嵌套式PCR扩增桔小实蝇rDNA中ITS间断序列的方法。

背景技术

桔小实蝇(Bactrocera dorsalis(Hendel))是一种直接危害果蔬生产并对出口贸易形成重要影响的检疫性害虫，原产亚洲热带或亚热带地区，现已成为东南亚、印度次大陆和夏威夷群岛一带的危险性果蔬害虫，是我国植物检疫的主要对象之一。目前桔小实蝇的口岸检疫鉴定工作中，主要以成虫外部形态特征为依据，而口岸截获的往往是幼虫或卵，通常做法是对其进行室内饲养获得成虫后再进行鉴定。

随着分子生物学的飞速发展，聚合酶链式反应(PCR)技术、核酸序列分析技术等分子技术在分类学、系统学、遗传学、生态学等领域和学科得到广泛应用。以分子生物学为实验手段，研究昆虫分类鉴定、类群遗传结构、系统发育和分子进化为主要内容的昆虫分子系统学是近年来新兴学科之一。虽然上述技术已经在植物检验检疫病毒、真菌和线虫等检疫性病害检测中得到应用，但用于检疫性昆虫的鉴定和区分则相对较少。在NCBI上搜索发现，近年来美国、新西兰、澳大利亚等相继注册了有关桔小实蝇的基因序列，美国Davis等(2000)注册了夏威夷桔小实蝇的无果基因(fruitless gene)BTB序列；新西兰Armstrong(1997)测定了该虫两个品系的ITS1部分序列、rRNA5.8S的全序列以及ITS2部分序列；澳大利亚昆士兰大学Hoeben等(1997)测定了Tabiti品系的mtDNA环区的全序列以及核糖体基因18S的部分序列。我国运用分子生物学技术探讨桔小实蝇种类鉴定、种群分化的研究报道较少。为了快速、准确地确认疫情并保护果蔬生产。开展对桔小实蝇的分子鉴定研究是非常必要的。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种嵌套式PCR扩增桔小实蝇rDNA中ITS间断序列的方法。可用于快速检测水果中桔小实蝇卵的分子诊断方法。可快速、准确地确认疫情并保护果蔬生产．

本发明专利申请，主要是申请保护设计的PCR引物片段DNA序列，以及PCR片段DNA序列。

本发明的技术方案是：

一种嵌套式PCR扩增桔小实蝇rDNA中ITS间断序列方法：

(1)试验材料与方法：

(1.1)供试样品和虫源

将柑橘削去直径3-4厘米，厚度2毫米的外皮，放入培养箱，取经实验室饲养至成虫的桔小实蝇雌、雄各一只放入培养箱中，待雌虫产卵，取柑橘提取总的基因组DNA；

(1.2)基因组DNA提取(CTAB法)

将柑橘削去外皮部分切割出长和宽为0.5厘米、厚0.2厘米的方块，用于基因组DNA提取；DNA的提取和质量检测方法参照分子克隆手册；DNA样品放于-20℃冰箱保存；具体如下：植物材料液氮冷冻(每个eppendorf管约0.05g)--磨棒捣碎(快速)，然后加入500ul 2％CTAB，混匀，65℃保温30min以上，中间注意摇动，加入氯仿∶异戊醇(24∶1)500ul震荡混匀，12000rpm，10min离心，取上清，加等体积的异丙醇，-20℃放置30min以上；再次10000rpm，5min离心，弃上清，用70％乙醇洗一次，10000rpm，5min离心，弃上清，彻底晾干，加30ul TE溶解基因组DNA；

(1.3)引物设计

引物设计参照NCBI上公开的桔小实蝇rDNA基因序列，第一轮PCR引物，正向引物PF-1：5’TGACCTAAGACATGCGCAGCTT 3’；反向引物PR-1：5’GGGACTTAAGGTCTAGGTCACA 3’；

第一轮PCR产物DNA序列：

tgacct aagacatgcg cagcttgcaa atgtttgggt

ttaaaattac aatttattga aagatgtgtt ggaattttat tttaaaaatt tgttataaat

attattatta ttattctttc aataaattaa aaactcttga ctttgaatca aaaaacacaa

aaaattttta ctctaagcgg tggatcactc ggctcatgca tcgatgaaga acgcagcaaa

ctgtgcgtca tcgtgtgaac tgcaggacac atgaacatcg acattttgaa cgcatattgc

ggtccatgct gttatgtact ttaattaatt ttaaagtgct gcttggacta catatggttg