[发明专利]一种快速检测水果中桔小实蝇卵的分子诊断方法

说明书

技术领域

本发明属于生物检测技术，特别涉及一种快速检测水果中桔小实蝇(Bactrocera dorsalis)卵的分子诊断方法。

背景技术

桔小实蝇(Bactrocera dorsalis(Hendel))是一种直接危害果蔬生产并对出口贸易形成重要影响的检疫性害虫，原产亚洲热带或亚热带地区，现已成为东南亚、印度次大陆和夏威夷群岛一带的危险性果蔬害虫，是我国植物检疫的主要对象之一。目前桔小实蝇的口岸检疫鉴定工作中，主要以成虫外部形态特征为依据，而口岸截获的往往是幼虫或卵，通常做法是对其进行室内饲养获得成虫后再进行鉴定。

随着分子生物学的飞速发展，聚合酶链式反应(PCR)技术、核酸序列分析技术等分子技术在分类学、系统学、遗传学、生态学等领域和学科得到广泛应用。以分子生物学为实验手段，研究昆虫分类鉴定、类群遗传结构、系统发育和分子进化为主要内容的昆虫分子系统学是近年来新兴学科之一。虽然上述技术已经在植物检验检疫病毒、真菌和线虫等检疫性病害检测中得到应用，但用于检疫性昆虫的鉴定和区分则相对较少。在NCBI上搜索发现，近年来美国、新西兰、澳大利亚等相继注册了有关桔小实蝇的基因序列，美国Davis等(2000)注册了夏威夷桔小实蝇的无果基因(fruitless gene)BTB序列；新西兰Armstrong(1997)测定了该虫两个品系的ITS1部分序列、rRNA5.8S的全序列以及ITS2部分序列；澳大利亚昆士兰大学Hoeben等(1997)测定了Tabiti品系的mtDNA环区的全序列以及核糖体基因18S的部分序列。我国运用分子生物学技术探讨桔小实蝇种类鉴定、种群分化的研究报道较少。为了快速、准确地确认疫情并保护果蔬生产.开展对桔小实蝇的分子鉴定研究是非常必要的。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种快速检测水果中桔小实蝇卵的分子诊断方法。可快速、准确地确认疫情并保护果蔬生产.

本发明专利申请，使用的PCR方法用于快速鉴定果实中桔小实蝇卵。

本发明的技术方案是：

一种利用嵌套式PCR扩增桔小实蝇rDNA中ITS间断序列快速检测水果中桔小实蝇卵的分子诊断方法：使用的PCR方法用于快速鉴定果实中桔小实蝇卵(1)PCR检测样品中桔小实蝇卵

首先用通用的PCR程序去扩增三个样品中目的片段，既PCR扩增条件为94℃预变性2min，共运行30个循环；每一循环包括：95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，最后一次循环后72℃延伸5min；PCR产物点入1％琼脂糖凝胶，电泳检测结果；第一轮PCR产物大小为637bp，从该PCR反应液中取出2微升稀释100倍，再从稀释样品中取1微升作为下一轮PCR的模板，第二轮PCR产物大小为432bp；普通的PCR程序能够检测出柑橘果实中桔小实蝇的rDNA基因片段，本试验设计的嵌套式PCR引物均正常工作；含不同数量桔小实蝇卵的柑橘果实样品，通过PCR扩增实蝇rDNA片段，都得到很强的目的条带；

(2)PCR程序优化

鉴于通用PCR程序对3组果实样品中的桔小实蝇卵都扩增出很强的条带，我们把PCR程序进一步优化，以达到缩短PCR运行时间，快速鉴定目的条带；PCR循环数设定为5(C1)、15(C2)、25(C3)，对桔小实蝇卵含量最少的样品S1进行PCR鉴定；PCR产物电泳结果，循环数降低对PCR产物量影响很大，基于有利于鉴定，我们选取循环数15(C2)为可识别的标准值；

(3)PCR片段序列对比

从电泳后的琼脂糖凝胶中分别回收两轮PCR产物，纯化后直接送样测序；序列对比分析发现，本试验中第二轮PCR产物GS-F，片段大小为432bp，其全序列与第一轮PCR产物GB-F，片段大小为637bp的部分序列完全相同，且被包含于其中；证明第二轮PCR产物是第一轮PCR产物的特异扩增片段；二者DNA序列对比，可以确定，第二轮PCR产物GS-F是第一轮PCR产物GB-F的一部分；

将PCR产物GB-F的DNA序列进行生物信息分析，PCR产物GB-F片段序列跨越桔小实蝇rDNA间隔区ITS-1与ITS-2；通过将GB-F的DNA序列在NCBI上进行BLAST，所检测的实蝇卵与桔小实蝇亲缘关系最近，序列对比二者间同源性百分之百，因此可确定本试验所用虫源是桔小实蝇；生物信息分析结果进一步确证了本试验中设计的嵌套式PCR引物能够精确、快速鉴定出果实样品中的桔小实蝇卵。

本发明效果是：