[发明专利]能利用木糖生产乙醇的重组运动发酵单胞菌及发酵方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域，涉及一种能利用木糖生产乙醇的重组运动发酵单胞菌及发酵方法。

背景技术

随着化石能源的日益枯竭，温室效应的逐步显现，清洁可替代能源已成为全球的研究热点，以木质纤维素为原料发酵生产燃料乙醇的研发工作更是备受关注。自然界中可再生的木质纤维素资源极为丰富，其主要成份之一是半纤维素。半纤维素中的85％～90％为木糖(Lachke 2002)，因此利用木糖发酵生产乙醇对木质纤维素的有效利用、解决当前能源危机有重要意义。

然而，自然界中高效产醇的菌种通常只能利用葡萄糖等六碳糖生产乙醇，不能利用木糖；而少数能利用木糖产醇的菌株，产醇能力低下，这限制了对自然界中木质纤维素的有效利用。运动发酵单胞菌具有产醇量高、生物量形成少、无氧气需求、乙醇耐受性高、糖浓度耐受性高等优点，但其利用的底物范围较窄，只能利用葡萄糖、果糖和蔗糖等六碳糖发酵(Rogers 2007)。若构建能利用木糖产醇的重组运动发酵单胞菌，使其能有效利用木质纤维素各组分，对清洁可替代能源的生产有重要的意义。

运动发酵单胞菌利用ED(Entner-Doudoroff)途径实现高效产醇，缺少完整的磷酸戊糖途径(pentose phosphate pathway)，要引入木糖异构酶、木酮糖激酶、转醛酶和转酮酶才能构成完整的代谢途径，转换木糖成ED途径的中间产物，使运动发酵单胞菌能发酵木糖生产乙醇。

欲将外源木糖异构酶、木酮糖激酶、转醛酶和转酮酶基因在运动发酵单胞菌中表达，须考虑表达载体和外源基因的性质、启动子和SD序列、宿主菌调控系统等。运用基因工程改良宿主菌的代谢途径或运用低拷贝的质粒作表达载体表达目的基因时，可通过改变目的基因的mRNA稳定性来调控基因表达，mRNA稳定性的增加将使mRNA的丰度增加，会导致蛋白表达量按比例的增加(Smolke 2000；Pfleger 2006)。提高mRNA稳定性可通过改变目的基因的调控元件来实现，诸如改变非翻译区的二级结构，核糖体结合序列等调控元件(Carrier 1997)。转录终止子对外源基因在细菌中的高效表达有重要作用。

大肠杆菌rrnB操纵元T1T2是强而有力的转录终止子，可以有效预防转录中的通读现象并保证表达质粒的稳定性，进而提高外源基因在原核细胞中的表达水平，大肠杆菌的rrnB能增加外源基因在大肠杆菌中、枯草芽孢杆菌中外源基因的表达量(戎2005；Wang 1992)；然而目前未有将rrnB与木糖代谢相关基因组成操纵子在运动发酵单胞菌中使用的报道。J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔，分子克隆实验指南(上册)(第三版)，黄培堂等译，北京：科学出版 社，2002

Carrier TA and Keasling JD.Controlling Messenger RNA Stability in Bacteria：Strategies forengineering Gene Expression.Biotechnol.Prog.1997，13：699-708.

Lachke A.Biofuel from D-xylose-the second most abundant sugar.Resource，2002，50：50-58.

Pfleger BF，Pitera DJ，Smolke CD，Keaslin JD.Combinatorial engineering of intergenic regions inoperons tunes expression of multiple genes.Nature Biotechnology.2006，24：1027-1032.

Rogers PL，Jeon YJ，Lee KJ，et al.Zymomonas mobilis for Fuel Ethanol and Higher ValueProducts.Adv Biochemical Eng Biotechnology，2007，108：263-288.

Smolke CD，Carrier TA，Keasling JD. Coordinated Differential Expression of Two Genes throughDirected mRNA Cleavage and Stabilization by

Wang，LF，Doi RH.Heterologous gene expression in Bacillus subtilis.Biotechnology，1992，22：63-104.