[发明专利]文蛤组织蛋白酶B基因及编码蛋白和应用

说明书

技术领域

本发明涉及文蛤组织蛋白酶B基因克隆及体外重组表达技术，具体地说是从文蛤cDNA文库中克隆出文蛤组织蛋白酶B基因的cDNA全序列并对该序列进行了原核重组表达，还涉及到该基因及其表达产物在贝类幼虫生长发育促进剂、饲料添加剂以及贝类苗种生产中的应用。

背景技术

在无脊椎动物消化营养物质的酶类中，组织蛋白酶类是人们关注的热点(Williamson et al.，2003)。其中，组织蛋白酶是一大类裂解肽键的蛋白水解酶，因其催化中心不同而分为四种类型，分别为半胱氨酸蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。其中半胱氨酸蛋白酶是十分重要的一类，组织蛋白酶B(EC 3.4.22.1)属于半胱氨酸蛋白酶之一(McGrath，1999)。组织蛋白酶B是唯一一个同时具有外切酶活性和内切酶活性的组织蛋白酶(Omar Quraishi 1999)，该特点决定了组织蛋白酶B在多肽的分解中具有重要的作用，因此以该蛋白酶主要研究对象可以成为研究在幼虫营养过程的分子机制的突破口。

文蛤是一种在东亚各国沿海和滩涂地区广泛分布的双壳贝类(Wang et al.，1993)。在我国沿海，文蛤作为一种重要的经济贝类而被广泛养殖(Liu et al.，2006)，文蛤苗种的人工繁育成为这一产业发展的关键环节之一。与众多双壳贝类发育过程相似，文蛤幼虫发育也需经过一段浮游阶段然后转入底栖生活。在贝类种苗的人工繁育过程中，早期幼虫营养状况不仅直接影响幼虫的生长发育，还会影响幼虫变态时的大小和变态后幼体的生长率及成活率(Phillips，2002)。所以，养殖业苗种培育过程中，幼虫营养状况会直接影响苗种的成活率和生产效益。组织蛋白酶B的活性特点和生物学功能，决定了其在贝类幼虫生长发育中重要的营养代谢调控功能。组织蛋白酶B作为重要的贝类幼虫营养调控酶类，对促进文蛤等贝类幼虫生长和发育，提高苗种繁育的稳定性和生产效益具有重要的应用潜力。

发明内容

本发明的目的是提供一种文蛤组织蛋白酶B基因及其编码蛋白和该基因体外重组表达的应用，本发明从文蛤中克隆到组织蛋白酶B，并对其进行原核重组及重组产物的活性鉴定，为进一步研究文蛤幼体生长发育机制提供基础，并为文蛤的苗种生产和进一步开发为饲料添加剂和医药产品奠定基础。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

利用构建cDNA文库，采用RACE技术以及体外重组表达等技术，从文蛤幼虫中克隆到组织蛋白酶B基因，cDNA(MmeCB)全长1647bp，编码框长为1014bp，3’非翻译区长624bp，发现组织蛋白酶B具有特有的封闭环序列，其对于该蛋白酶结合底物发挥外切酶活性具有重要作用，该基因在文蛤营养代谢方面发挥着重要作用。它具有SEQ ID NO.1所示的序列。

其编码的蛋白成熟肽具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，利用pGEX-4T-1表达载体在大肠杆菌BL21(DE3)重组表达了该蛋白，分子量为37.3kDa，等电点为5.50。表达产物对其特异性底物carbobenzoxy-l-arginyl-l-arginyl-7    -amino-4-trifluoromethylcoumarin(Z-Arg-Arg-AFC)有分解作用，其动力学参数Km，Vmax and kcat分别为6.11μM，0.0174μM·min^-1和277.57s^-1，kcat/Km值是45.4mM^-1·s^-1。组织蛋白酶包括2个结构域，其中L域由3个有规则的α螺旋组成，R域由C端6个延长的核苷酸链以反向平行形成β折叠，且不闭合。

本发明利用表达序列标签(EST)技术、cDNA末端快速扩增(RACE)技术从文蛤中克隆到组织蛋白酶B基因cDNA全长序列，通过PCR技术，扩增编码组织蛋白酶B成熟肽的基因片段并将其克隆到pGEX-4T-1表达载体中，在大肠杆菌BL21(DE3)实现体外重组表达。重组产物经GSTrap affinity columns纯化，并用凝血酶直接在柱子上切掉GST，获得MmeCB，对其特异性底物Z-Arg-Arg-AFC有分解作用，本发明可以为进一步研究文蛤幼体生长发育机制提供基础，并为文蛤的苗种繁育和饲料添加剂奠定基础，同时为进一步开发医药产品提供可能。

附图说明

图1：GSTrap FF柱纯化重组文蛤组织蛋白酶B，图中1：标准蛋白分子量，2：BSA(1mg/ml)，3：酶切后目的蛋白MmeCB；