[发明专利]一种防止载细胞海藻酸钠微囊皱缩的方法

说明书

技术领域

本发明涉及微囊化细胞工程的生物医药领域，更具体地说，涉及一种防止载细胞海藻酸钠微囊皱缩的新方法。

背景技术

利用微囊包裹具有特定功能的组织细胞，形成免疫隔离的人工细胞，以此植入患病动物或病人体内，可补充疾病体内缺乏的生理活性物质，从而达到治疗疾病的目的。

采用海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠(APA)或海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠(ACA)制作的三层结构膜微囊，具有体积小(粒径大小200-1000μm)，生物相容性好，表面积大，有利于微囊化细胞在动物体内较长时间存活。大量的实验表明，APA微囊的囊膜可截留分子量大于11万的分子，从而使免疫球蛋白分子和免疫活性细胞不能透过囊膜而进入囊内破坏其中的动物细胞，因而具有较好的免疫保护作用。

APA或ACA微囊包裹细胞或组织的微囊化细胞制备工艺，主要包括：细胞与海藻酸钠溶液混合、成球、包覆聚赖氨酸、包覆海藻酸钠和洗出游离海藻酸钠、微囊液化等步骤。首先将细胞或组织与适当浓度的海藻酸钠溶液混合均匀，然后用高压静电液滴法或气流切割法将混合液滴至固化溶液中(等渗的CaCl₂溶液)形成海藻酸钙微球，然后再将微球先后投入到适当浓度的聚赖氨酸溶液(或壳聚糖溶液)和海藻酸钠溶液中包覆聚赖氨酸(或壳聚糖溶液)和海藻酸钠，最后将微球投入到柠檬酸钠溶液中洗出游离的海藻酸钠，液化微球的核心，即可获得APA、ACA微囊的细胞或组织。

关于APA、ACA微囊化的细胞或组织的制备工艺，目前文献和专利报道的APA，ACA微囊的制备方法，一般采用高压静电液滴法(Electrostatic droplet generation)。例如，文献报道中，杨晓明等(杨晓明，毕好生，杨茂元等，微囊化人嗜铬细胞体外培养的研究[J].中华麻醉学杂志，2001；21(7)：410-413.)利用加拿大产微囊静电仪，采用高压静电法制备了人的肾上腺嗜铬细胞的海藻酸钠微囊。专利文献报道中，薛毅珑(CN1345234，用于治疗疼痛的微囊化牛肾上腺髓质嗜铬细胞药物；CN1242197用于治疗帕金森病的微囊化牛肾上腺髓质嗜铬细胞药物)采用高压静电液滴法制备了微囊化牛肾上腺髓质嗜铬细胞，该细胞药物能在人体内长期地分泌镇痛物质和多巴胺，植入一次可以止痛数个月以上，可用于治疗疼痛和帕金森病。李涛(CN1454995，利用海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠微囊包埋细胞或组织的方法)采用高压静电液滴法制备不同孔径的ACA微囊化细胞或组织。该法制备的ACA微囊孔径容易控制且分布均匀，通透性能好，故可广泛用于包埋肝、肾上腺、甲状腺、甲状旁腺、性腺等细胞或胰岛等组织。

高压静电液滴法的原理如下：在高压静电场下，海藻酸钠液滴表面带静电，由于电荷的排斥作用，可使注射器针头生成的液滴大小均匀，表面张力变大而使液滴收缩更为圆整，滴入CaCl₂溶液的固化液后，就可获得粒径大小均匀的海藻酸钙微球，从而最终能够制备大小均匀的APA、ACA微囊。

近来，为适应工业化生产要求，采用其他原理进行细胞微囊化的工艺应运而生。其中振动喷嘴法(Vibratingjet breakup)因具有生产效率高，粒径分布窄的优点，越来越广泛应用于细胞微囊化的实验应用和工业化生产中。例如，Wei Ouyang等(Wei Ouyang，HongmeiChen，Mitchell L. Artificial cell microcapsule for oral delivery of live bacterial cells for therapy：design，preparation，and in-vitro characterization[J].J Pharm Pharmaceut Sci，2004；7(3)：315-324)采用振动喷嘴法，利用Inotech Encapsulator IER-20型微囊仪，制备包封人工细胞APA微囊，口服给药用来治疗肠道疾病。

振动喷嘴法的原理同样也是利用了液体的表面张力作用和高压静电作用，但是为了加快液滴生产的速率，提高微囊的制备效率，利用电磁振动原理，快速生产液滴。这样海藻酸钠液滴，在电磁振动作用下快速生成液滴；高压静电场的作用下，液滴荷电，静电排斥力使液滴表面张力增大。在电磁振动和静电场的双重作用下，液滴的生成更加均匀，大小更为集中，这样就大大提高了微囊的制备效率。