[发明专利]利用特异性引物对大菱鲆FF0922微卫星标记的检测方法

说明书

技术领域：

本发明属于大菱鲆DNA分子遗传标记技术，是一种检测大菱鲆FF0922微卫星标记技术方法。

背景技术：

本发明做出之前，国内外有类似的报道，国内中国水产科学院黄海水产研究所陈松林等(Molecular Ecology Notes 2007)发表的Isolation andcharacterization of polymorphic microsatellite loci from ESTlibrary of turbot(Scophthalmus maximus)and cross-speciesamplification，曾报道了大菱鲆部分微卫星位点的检测方法，但大菱鲆基因组文库并非自己构建，而是从已有的报道里选取的；孙效文等(ConservGenet 2009)发表的Isolation and characterization of microsatellitemarkers for turbo(Scophthalmus maximus)by screening SSR-enrichedlibrary，曾报道了大菱鲆部分基因组文库的构建、含微卫星序列的筛选等内容，但其有的引物扩增出的序列等位基因太少，多态性不高，从而导致应用时不能有效地区分不同群体或个体；西班牙Pardo等(Genome 2007)发表的Development and characterization of 248 novel microsatellitemarkers in turbot，曾报道用构建大菱鲆微卫星富集文库的方法筛选出248个微卫星位点，并设计了引物为构建遗传连锁图谱提供条件，但未见对每个引物多态性情况的报道。

发明内容：

本发明的目的是提出一种自主构建大菱鲆基因富集文库，并从中筛选出微卫星序列，在其两端设计特异性引物进行PCR检测，从而快速的检测大菱鲆每个个体在微卫星区的遗传变异，获得该引物对大菱鲆多态性图谱，通过图谱检测出每个个体的基因型，以期找到与该微卫星位点连锁的性状，为以后与传统方法结合进行育种工作奠定基础。

本发明是按照以下操作技术方案完成的：首先是提取大菱鲆基因组DNA并稀释备用；再利用大菱鲆基因组文库中的含有微卫星核心序列，在其两端设计特异性引物；然后使用该引物对大菱鲆不同地理群体或同一群体中不同个体的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行检测；利用产物出现的条带进行分析，确定每个个体的基因型，并获得大菱鲆的遗传多态性图谱。

提取大菱鲆基因组DNA将其稀释为50ng/ul，每个PCR反应中加入2ul，反应总体积为25ul。

FF0922微卫星核心序列及其两端保守序列为：

1 ATGTGCTGTG TCAGACTGTT TATCTGTGAG AAAACAGGCA ATCAGAGAGG

51 GCGCTCACAT ATTATTGAAA TGACATGAAA TCCATGTTAC TCCACACTCA

101 AGTCGTATAT GCAAGCTAGA ATGGTGAATC TCTTCTTGTC TCCTACAGAC

151 AGACAAACAC ACACACACAC ACACACACAC ACACACACAC ACAAACACAT

201 ACACAAAACA AGACCAACAG TGACATGATA TAACATGATC ACCAAATCAC

251 AGAAACTGTA GGGGAGAAGG GGAAAAAAAG CTAATAAAGC TATAGCAAAA

301 TTAGAACTGT GCTGTAGGCA GATCCAGTGT CTCCAGTAAT CTACATAAGC

351 AGCAGTTGTC GT；

根据其设计的特异性引物为：正链5’-TGTGAGAAAACAGGCAATC-3’负链5’-CAGTTTCTGTGATTTGGTGAT-3’，使用引物时退火温度60℃。

PCR扩增的加样参数为：每个PCR反应总体积为25ul，包括100ng大菱鲆基因组DNA；10×PCR buffer，2.5ul；Mg²⁺，2mmol/L；Taq酶1U；dNTP各0.2mmol/L；本发明在FF0922微卫星核心序列两端设计的引物各0.2umol/L；加ddH₂O至25ul。使用该引物时设置PCR仪的程序为94℃变性4min；94℃30sec，60℃50sec，72℃50sec，30个循环；72℃延伸7min，4℃保存。