[发明专利]一种牙鲆精子大容量冷冻保存方法

说明书

技术领域

本发明属海洋生物技术领域，具体地说是一种牙鲆精子大容量冷冻保存方法，把牙鲆精子大容量冷冻、液氮保存及解冻洗脱，获取具有受精能力精子的过程。

背景技术

牙鲆是我国重要的海洋经济鱼类，它不仅是我国重要的捕捞对象，也是主要的海水增养殖种类。牙鲆分布于北太平洋西部，使太平洋西岸东北亚的特有种，主要分布于中国的渤海、黄海、东海、南海以及朝鲜半岛、日本、俄国远东沿岸海域。近三十年来，由于捕捞过度，加之环境污染日趋严重，牙鲆的自然资源严重衰退。

鱼类精液的超低温保存在水产养殖、遗传育种以及种质资源保存中具有重要的意义。鱼类精液的超低温保存可以使种质的长距离运输得以实现，同时有利于鱼类的杂交、选育、优良形状的获得以及基因多样性的保护。中国随着海水养殖业发展的迫切需要以及对海洋种质资源保护的认识，海洋鱼类精液的超低温保存取得了巨大的进展，对于一些具有较高的经济价值鱼类的精液，如真鲷、黑鲷、大菱鲆、大黄鱼和牙鲆，进行了成功的超低温保存研究。目前，鱼类精子冷冻保存的容量为2ml，精子密度低，保存数量少。因此，建立牙鲆精子大容量超低温保存的可靠方法对海水养殖业的发展以及生物多样性的保护具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种牙鲆精子大容量冷冻保存方法，解决现有技术中存在的牙鲆精子保存容量小、密度低、保存数量少等问题。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种牙鲆精子大容量冷冻保存方法，采集牙鲆精液后，放入冻存管添加抗冻液，在0～4℃预冷9～11分钟，分段降温至-180℃后投入液氮中保存。

所述冻存管体积为5ml，抗冻液是以平衡盐溶液Hank’s为基液，其中含有体积含量15％(V/V)的丙二醇(PG)一种抗冻剂；分段降温是指0～-80℃降温速度为20℃/分钟，-80℃时平衡2分钟，-80～-180℃降温速度为30℃/分钟。

所述精液与抗冻液的体积比为1∶1。

所述保存后的牙鲆精液解冻时，放入40～42℃水浴锅中解冻至开始融化后，进行室温解冻。

本发明具有如下优点：

1、本发明采用5ml冻存管容积大，保存精液量大。

2、本发明采用丙二醇(PG)为抗冻剂，毒性小。

3、本发明分段降温时，先采用以20℃/分钟速度快速降温，使冷冻精子安全快速度过“危险温度区”，降低胞内冰晶的冷冻损伤。

4、本发明冷冻精子从液氮中取出后，直接放入40～42℃中水温解冻，快速度过重结晶区，减少重结晶对精子的损伤。

总之，本发明的牙鲆精子大容量冷冻保存，对于牙鲆这种海水名贵鱼类的育种、种质保存、遗传多样性及可持续养殖等方面有着重要意义。

具体实施方式

实施例：

本发明牙鲆精子大容量冷冻保存方法，步骤如下：

(1)取体积为5ml的冻存管，采集牙鲆精液后，放入冻存管添加抗冻液，精液与抗冻液体积比1∶1。抗冻液以平衡盐溶液Hank’s为基液，采用丙二醇(PG)为抗冻剂，抗冻液中丙二醇的体积含量为15％。冻存管在0～4℃冰箱中平衡10分钟，从冰箱中取6个5ml的冻存管，各吸取5ml混合液，快速放入程序降温仪，开始降温。

(2)降温程序为：0～-80℃，降温速度为20℃/min；-80℃平衡2分钟；-80～-180℃，降温速度为30℃/min；降至-180℃时，迅速将冻存管投入液氮罐中保存。

(3)保存4个月后取出冻存管，迅速放入41℃水浴锅中解冻，开始融化后室温解冻。

(4)解冻后，用海水激活进行镜检，精子复活率大于80％。