[发明专利]一种快速分离鉴定仿刺参微卫星标记方法

权利要求书

1.一种快速分离鉴定仿刺参微卫星标记方法，其特征在于：

(1)、提取仿刺参的基因组DNA：

将仿刺参活体解剖后取肌肉组织200mg，加入500μl CTAB裂解液，剪碎，60℃处理，直到裂解液澄清，加入等体积饱和酚250μl、重量比为24∶1氯仿/异戊醇250μl，抽提3次，取上清液，加入等体积氯仿/异戊醇500μl抽提1次，取上清液，加入50μl NaAc 3M，缓慢摇匀，加满冰无水乙醇，12,000转离心10分钟，将核酸沉淀于管底，重量浓度为70％的乙醇洗涤沉淀并干燥直到乙醇全部挥发，加入100μl的无菌水和RNase A，4℃直到DNA全部溶解；

(2)、富集文库的构建：

①、仿刺参基因组DNA片段获得：在构建富集文库时，限制性酶切片段获得的方法为：取300ng仿刺参总DNA，在20μl体系中用限制性内切酶HaeIII酶切3个小时，酶切后T4连接酶连上接头，连接反应为30μl，其中含有酶切产物20μl，接头50ng，1×T4连接缓冲液，T4连接酶2U，反应在16℃下进行12小时，连有接头的DNA经PCR扩增获得多个拷贝，PCR反应总体积为25μl，其中含有DNA片段的连接产物6μl，1mM的21-mer引物，200mmol/L的dNTPs，200mmol/L的Mg²⁺，1×PCR反应缓冲液，1U的Taq DNA聚合酶，PCR反应为25个循环，每个循环包括：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min；首次循环前预变性5min；最后一次循环结束后72℃再延伸5min，PCR结束后，5个反应体系混合乙醇沉淀，加入20μl三蒸水溶解，95度变性5分钟待用；

②、基因组片段的富集：①杂交膜的准备：取浓度为100mM的探针(GA)₂₀和(CA)₂₀各0.5μl点在直径为5mm的Hybond N⁺杂交膜上，空气中晾干后80℃烘烤2小时固定探针，将固定好的探针HybondN⁺膜放在杂交液中37℃预杂交72小时，然后将膜在1％的SDS中沸浴10分钟，去除没有结合好的探针；②杂交：将变性好的基因组DNA片段加入到600μl的杂交液中，加入预杂交好的Hybond N+膜，37℃杂交1-2天；③洗脱：洗膜采用如下严谨度：用600μl的2×SSC，1％SDS(W/V)洗脱液在60℃下水浴下洗脱2次，每次15分钟；用600μl的2×SSC，1％SDS(W/V)洗脱液在62℃下水浴30分钟；用500μl的0.5×SSC，1％SDS(W/V)洗脱液在65℃下水浴30分钟洗脱杂交片段，再将500μl的洗脱液中加入100μl的7.5M NH₄Ac和600μl的异丙醇，-20℃冷冻不少于2小时，4℃12,000转离心20分钟，将沉淀用-20℃预冷的75％乙醇洗2次，溶于20μl的三蒸水；

③、富集产物的克隆：取洗脱片段溶液2μl作为恢复PCR(Recovery PCR)的模板，反应为20个循环，最后72℃延伸30分钟；PCR反应结束后乙醇沉淀，三蒸水溶解，富集DNA片段的克隆采用市售的pMD18-T载体试剂盒，连接反应参照市售的pMD18-T载体试剂盒说明，将连接好的产物转化至大肠杆菌DH5α菌株中，涂于含有X-gal的固体LA平板上；

(3)、菌落原位杂交筛选阳性克隆：

①、菌落重排与转膜：将转化后的白斑重新挑起，有序的重排接种至新的固体LB培养基上，37℃培养；培养好菌落转至尼龙膜上，然后将膜在空气中干燥10分钟，然后尼龙膜放入变性缓冲液中变性7分钟，空气干燥10分钟，中和缓冲液中和2次，每次5分钟，将中和好的尼龙膜空气干燥后放入80℃烘烤2小时固定质粒；

②、探针的标记：探针的标记采用市售的DIG Oligonucleotide3’-End Labeling Kit，2nd generation，标记反应在37℃下标记15分钟，20μl反应体系中含有100pmol的探针1μl，0.05mM DIG-ddUTPsolution 5μl，5×Reaction Buffer 4μl，5mM CoCl₂ solution 4μl，20U的末端转移酶，标记好的探针放入-20℃冰箱中备用；

③、杂交：杂交系统采用市售的DIG Easy Hyb试剂盒；将烘烤好的尼龙膜放入杂交液中预杂交1小时，然后将杂交液去除，加入足量的杂交液和标记好的探针，使杂交液的量为0.125-0.25mL/cm²，探针的浓度为5-10ng/mL，37℃振荡杂交过夜；

④、洗脱：将杂交过夜的尼龙膜放在2×SSC，0.1％SDS的洗脱液中室温振荡洗脱2次，每次5分钟，然后在含有0.5×SSC，0.1％SDS的洗脱液中37℃振荡洗脱2次，每次15分钟；

⑤、抗体-抗原反应与放射自显影：抗体-抗原反应系统采用市售的DIG Luminescent Detection Kit，将膜放入到BlockingSolutions中封阻30分钟，然后将膜放入到Antibody Solution中反应30分钟，Antibody Solution中含有10000倍稀释的抗体，1％(W/V)Blocking Reagent，0.15M NaCl，0.1M Maleic acid，pH＝7.5，处理完尼龙膜后，在暗室中压上X光胶片，感光1小时后进行显影及定影；

⑥、阳性克隆的确定以及阳性克隆的测序：按照原先确定的方位，将X-胶片、尼龙膜、平板三者进行对照，在相同的位置上挑出阳性克隆，用M13引物测序；

(4)、引物设计：

在测序的基础上，利用微卫星DNA两侧的序列的保守性设计特异性引物，用于扩增该位点的微卫星片段，引物设计采用软件PrimerPremier 5.0和Oligo 6.44，引物设计的引物长度为19-25mer；GC含量为40％-60％；退火温度为45-65℃；预期PCR产物长度为100-250bp。