[发明专利]一种大规模筛查扇贝SNP的方法

说明书

技术领域：

本发明属于扇贝DNA分子遗传标记技术领域，涉及一种大规模筛查扇贝SNP标记的方法。

背景技术：

SNP标记因其数目众多且具有稳定遗传性，在高密度遗传连锁图谱的构建和性状相关功能基因的QTL定位方面有广泛的应用。扇贝作为我国最重要的海水经济养殖贝类之一，在海水养殖产业中占有极其重要的地位。大规模筛查扇贝SNP标记对于扇贝高密度遗传图谱的构建和经济性状相关的QTL精细定位，并进一步进行分子设计育种至关重要。目前大规模筛查SNP标记在基因组信息丰富的人类和模式生物中应用较多，然而在基因组信息相对匮乏的扇贝上尚未见有报导过高效的、低成本的大规模筛查方法。随着新一代测序技术通量不断提高和成本持续下降，使得利用新一代测序技术来大规模筛查扇贝SNP标记成为可能。然而由于扇贝的基因组较大，有1.2G，且含有较多的重复序列，全基因组测序分离效率相对较低，因而以扇贝均一化的转录本为样品，结合高通量测序技术和生物信息学分析软件来筛查SNP标记，一方面避开重复序列，提高筛查效率；另一方面可同时获得与功能基因直接关联的SNP标记，具有通量高、效率高、成本低的特点，大规模筛查扇贝SNP标记的有效方法正在成为本技术领域中广大研发人员探究的课题。

发明内容：

本发明的目的在于寻求一种大规模筛查栉孔扇贝SNP标记的方法，该方法利用高通量测序技术和生物信息学分析软件实现对扇贝进行大规模SNP标记的筛选。

为了实现上述目的，本发明按照以下操作七个步骤完成：

1、用溶液D和酚氯仿提取不同发育时期、不同地理群体的多个栉孔扇贝的多种组织的RNA，按比例混匀后紫外分光光度计测定其浓度备用；

2、构建扇贝全长cDNA样品：

参照SMARTTM cDNA Library Construction Kit，但需将cDNA合成引物的序列替换为5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTCGCAGTCGGTACTTTTTTCTTTTTTV-3’。

(1)cDNA第一链合成：

反转录反应以1ug RNA为模板，补RNase-Free水至4ul，加入1ul 10uM cDNA合成引物、1ul 10uM SMART IVTM Oligonucleotide(5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG-3’)，70℃温育3min，立即置冰上冷却1min；再加入1×First-StrandBuffer、1mM dNTP、0.01M DTT、1U Superscript II，混匀后42℃温育1h，65℃温育3min终止第一链的反应；

(2)cDNA第二链的合成与扩增：

PCR反应总体积为30ul，包含1ul稀释5倍的cDNA第一链产物，250uM dNTP，0.46uM NUP引物(5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’)，1U Advantage 2Polymerase Mix，1×Advantage 2 PCR buffer，反应条件：94℃预变性5min，94℃变性40s，65℃退火1min，72℃延伸6min，进行15-19个循环，平行扩增16管，回收纯化扩增产物，1％琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测；

3、全长cDNA均一化：

具体步骤参照TRIMMER-DIRECT cDNA均一化说明书进行，均一化后再次扩增，PCR反应总体积为30ul，包含1ul cDNA均一化产物，250uM dNTP，0.46uM NUP引物，1U Advantage 2 Polymerase Mix，1×Advantage 2 PCR buffer；反应条件：94℃预变性5min，94℃变性40s，65℃退火1min，72℃延伸6min，进行15-19个循环，平行扩增16管，回收纯化扩增产物，1％琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测；

4、超声波打断：

取200ul cDNA(cDNA浓度为50-100ng/ul)于冰浴的1.5ml离心管，将超声波破碎仪的锥形探头浸没液面以下，20W功率破碎约20s，1％琼脂糖凝胶电泳检测片断大小，片段应主要集中在100~800bp之间，经过打断的样品回收纯化后电泳和紫外分光光度计检测；

5、连接测序接头：

(1)末端修复：