[发明专利]半乳糖的测定方法与半乳糖诊断/测定试剂盒--9049

说明书

【技术领域】

本发明涉及医学/食品检验测定技术领域，更具体地，本发明涉及半乳糖诊断/测定方法及其试剂盒。

【背景技术】

牛奶在营养界素有“液体黄金”的美称，我国早在1992年由七部位联合提出：“一杯牛奶强壮一个民族”的口号。奶类除不含纤维素外，几乎含有人体所需要的各种营养素。牛奶中的乳糖进入人体后，经小肠乳糖酶作用分解成葡萄糖和半乳糖。半乳糖是婴儿大脑发育的必需物质，与婴儿大脑的迅速成长有密切关系。

牛奶虽好但并不是所有的人都能享受，有些人由于乳糖酶的缺乏，人体不能很好的消化吸收牛奶中的营养素，还会造成钙、磷、钾、铁等元素的吸收障碍，影响婴幼儿的体格和智力发育，在老年人中，乳糖酶缺乏是造成骨质疏松的重要原因。中国成年人饮用牛乳后乳糖吸收不良的发病率高达86.7％，不耐受指数为0.9。

为了避免不适当饮奶对健康造成的损害，因此最好在饮奶前检查自己是否耐受乳糖，在饮用牛奶后，测试尿液中半乳糖的浓度，这是目前国外最常用的一种方法，更为简便、经济、可靠。

【发明内容】

[要解决的技术问题]

本发明的目的是提供一种半乳糖的测定方法。

本发明的另一个目的是提供一种半乳糖诊断/测定试剂盒。

[技术方案]

本发明是通过下述技术方案实现的。

本发明的方法是一种采用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)与酶(偶)联法(Couple Reaction)的联用技术，利用测定还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处的吸光度变化测定半乳糖的方法。

本发明半乳糖测定方法的的技术原理是根据下述半乳糖激酶、氨甲酰磷酸合成酶、异柠檬酸脱氢酶的系列催化反应完成：

半乳糖+腺苷三磷酸    半乳糖激酶    腺苷二磷酸+半乳糖1-磷酸

2腺苷二磷酸+磷酸根+氨甲酰磷酸    氨甲酰磷酸合成酶

2腺苷三磷酸+氨+二氧化碳+水

二氧化碳+酮戊二酸+还原型辅酶    异柠檬酸脱氢酶    异柠檬酸+辅酶

本发明的方法利用半乳糖激酶(galactokinase；EC 2.7.1.6)酶(偶)联氨甲酰磷酸合成酶(carbamoyl-phosphate synthase；EC 6.3.4.16)、异柠檬酸脱氢酶(isocitratedehydrogenase；EC 1.1.1.41；EC 1.1.1.42)酶促反应终点法。半乳糖激酶酶解半乳糖反应产生腺苷二磷酸，再通过(偶)联合氨甲酰磷酸合成酶、异柠檬酸脱氢酶的作用，最终将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的程度，这样可以通过测量340nm处吸光度下降的程度，可以测算半乳糖的浓度大小。

本发明是通过下述技术方案实现的。

本发明涉及一种半乳糖的测定方法。该半乳糖测定方法的步骤如下：

A、样品准备：

A.1标准样品的制备

将一定量的半乳糖溶于水或缓冲液中，再将半乳糖浓度调整到100微摩尔/升，得到的溶液作为标准样品；

A.2待测样品预处理

待测液体样品直接测试，无须预处理；将一定量的待测固体样品像制备标准样品一样溶于水或缓冲液中；

A.3空白样品

所述的水或缓冲液作为空白样品，其半乳糖浓度为0微摩尔/升；

B、试剂溶液的制备：

分别移取或称取缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、半乳糖激酶、氨甲酰磷酸合成酶、异柠檬酸脱氢酶、腺苷三磷酸、单价磷酸盐(磷酸根)、氨甲酰磷酸与酮戊二酸，然后将它们混合均匀，用水溶解得到所述的试剂溶液，它们的浓度分别是20-500mmol/L、0.001-7mol/L、0.1-0.35mmol/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、1-100mmol/L、1-100mmol/L、1-100mmol/L与1-100mmol/L；

C、待测样品与在步骤B)得到的试剂溶液按照体积比1/10至1/500进行混合，在温度15-45℃下反应5-60分钟，在主波长340nm与副波长405nm(如果受仪器限制可以不设副波长)下进行测定，测定其吸光度随时间的变化；