[发明专利]一种恩诺沙星的检测试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测恩诺沙星(Enrofloxacin，ENR)的检测试剂盒及其检测方法，属于时间分辨荧光免疫分析(Time resolvedfluoroisnmunoassay，TRFIA)技术领域，用于动物源性食品、血液、尿液及饲料中恩诺沙星药物残留量的检测。

背景技术

恩诺沙星(Enrofloxacin，ENR)是人工合成喹诺酮类抗菌药，因其高效广谱、耐药菌少、在动物体内吸收快、分布广、生物利用度高、代谢快，是一种低毒、低蓄积药物，与其他抗菌药无交叉耐药性而被广泛应用于畜禽和水产养殖中感染性疾病的防治。恩诺沙星在畜禽养殖和水产养殖业中广泛应用，会随畜禽的排泄物进入土壤和水体环境，形成耐药菌，对生态环境造成影响。恩诺沙星虽然其毒性不强，但是人使用过量后，可引起机体肠胃道反应、致幼年动物关节病变。依据联合国粮农组织(FAO)及世界卫生组织(WHO)之评估，恩诺沙星对人体ADI值(每日安全摄取量)为2kg体重，以60kg成人计算，即每人每日安全摄取量为120g/d。近年来，国内外有关食用动物和人类的耐喹诺酮菌株的发病率及种类的报道日渐上升，由于这类药易诱发细菌耐药性，有兽药残留动物源性食品被人类长期食用会出现蓄积中毒，从而可引起人畜关节软骨病、光敏反应、肝肾毒性及导致淋巴细胞染色体变异的基因毒性，及可引起人肌腱破裂。它作为一种人畜共用药，药物残留通过食物链对人体健康危害更大，不利于该类药物对人类疾病的治疗。因此世界各国十分重视此类药在动物性食品中的残留问题，加强了氟喹诺酮类药物监管力度。欧盟、美国、日本、中国等均对动物源性食品中环丙沙星最高残留限量都作了禁用或限用的规定。

目前检测动物源性食品中恩诺沙星残留的主要方法有微生物法、四平板法、荧光法、高效液相色谱法(HPLC)、液质联用法(LC-MS)、毛细管电泳法和酶联免疫吸附法(ELISA)等。常用的恩诺沙星检测方法是色谱检测法和免疫学检测法。色谱检测法灵敏、准确，需要昂贵的仪器和专门的工作人员，而且样品处理较烦琐，其应用受到一定的限制，尤其是在基层大规模筛选和现场检测中更加突出。免疫学检测法灵敏、特异、快速、简便，克服了以上的不足，适合大规模筛选。

时间分辨荧光免疫分析检测技术是近来发展迅速的高灵敏检测手段。TRFIA其原理是利用具有双功能基团结构的螯合剂，其一端和镧系元素结合，另一端和抗体(抗原)上的自由氨基连接，制成Eu³⁺标记抗体(抗原)，它与待测样品中的抗原(抗体)结合成免疫复合物。理想情况下，测定复合物中镧系元素的荧光强度就能确定样品中抗原的含量，但实际上这种复合物的荧光强度相当弱，只有再加入一种增强溶液(Enhancement solution)，使镧系元素从复合物中解离下来，并与增强液中所含的β-奈甲酰三氟丙酮(β-NTA)重新形成微胶囊，在紫外光的激发下发射很强的荧光，增强效果上百万倍。用时间分辨荧光仪测定其荧光强度cps，即可确定样品中抗原的量。

发明内容

本发明的目的在于提供一种恩诺沙星试剂盒及检测方法，用于定性或定量地检测物源性食品、血液、尿液及饲料中恩诺沙星的残留量；检测时间短、平均回收率高、批内、批间误差小，并具有简便、快速、准确的特点。

本发明的技术方案：该检测恩诺沙星的试剂盒是由1、多孔包被板，2、缓冲液，3、恩诺沙星标准溶液，4、恩诺沙星的抗体，5、铕标记的羊抗兔抗体，6、洗涤液，7、增强液所组成。

本发明主要采用时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)来检测ENR。采用TRFIA的技术主要有两个方面：第一，特异性多克隆抗体的制备，利用抗原免疫家兔，获得含有抗体的血清，经过生化提纯分离免疫球蛋白；第二，Eu³⁺标记抗体的制备。

测定方法为：测定的基础是标记免疫反应。包被有ENR-载体蛋白的微孔板，加入ENR标准溶液或样品处理液到各自的微孔中、再加入ENR抗体，振荡反应，游离的ENR与微孔板上的ENR-载体蛋白竞争ENR抗体，洗涤液洗涤，没有连接的ENR抗体在洗涤步骤中被除去。加入Eu³⁺-羊抗兔抗体，进行标记免疫反应，再用洗涤液洗涤，反应后没有连接的Eu³⁺-羊抗兔抗体在洗涤步骤中被除去。加增强液振荡后，在紫外光的激发下发射很强的荧光，用时间分辨荧光仪测定其荧光强度cps，荧光强度与样品中的浓度成反比，对照标准曲线即可确定样品中ENR的量。

本发明的有益效果：该试剂盒结构简单，使用方便、廉价、灵敏度高，可以达到0.01ng/mL以上。

附图说明