[发明专利]一种固定化酒用酸性脲酶的制备方法及应用

权利要求书

1.一种固定化酒用酸性脲酶的制备方法，其特征为：将从肠杆菌9043C₁₂中分离纯化的游离酶，经海藻酸钠和氯化钙包埋，壳聚糖吸附，微量戊二醛交联，得固定化酒用酸性脲酶，其工艺为：

A、游离酶提取：

(1)菌种：采用肠杆菌(Enterobacter sp.)9043C₁₂；

(2)种子培养：

种子培养基组成：种子培养基以g/L计：葡萄糖20，蛋白胨10，牛肉膏10，酵母膏5，KH₂PO₄2，NaCl 5，NaAc 2，尿素5，pH7.0；

培养条件：接种量5％，35℃恒温静置培养16～18h；

(3)发酵培养：

发酵培养基组成：以g/L计：葡萄糖20，蛋白胨10，牛肉膏5，酵母膏5，KH₂PO₄2，NaCl 5，NaAc 2，尿素5，四水硫酸锰0.05，六水硫酸镍0.05，pH5.5：

发酵液培养条件：接种量6％，35℃恒温静置培养28～32h；

(4)收集菌体：将发酵液8000r/min、4℃离心10min后，弃上清，将菌体用去离子水洗涤两次，pH5.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液洗涤一次，每升发酵液离心后所得菌体复溶于pH5.5的35mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中；

(5)超声波破碎：超声波功率300w，破碎时间10min，处理量35mL；将破碎液于4℃下13000r/min离心20min，收集上清液，即为游离酶酶液；

B、固定化过程：

(1)将海藻酸钠溶入游离酶酶液中，控制海藻酸钠的质量/体积浓度达2％，充分搅匀，4℃冷藏静置至无气泡；

(2)用注射器将步骤(1)的含海藻酸钠的游离酶酶液逐滴滴入其5倍体积的溶有质量/体积浓度0.25％壳聚糖和5％氯化钙的溶液中，磁力搅拌3h，去离子水洗涤，去除游离壳聚糖和氯化钙，沥干，得固定化小球；

(3)将步骤(2)所得固定化小球置于体积浓度0.1％戊二醛中，固定化小球质量/戊二醛体积控制为2g/mL，微波3min后，置于磁力搅拌器上磁力搅拌2.5h，去离子水洗涤，去除游离戊二醛，沥干，冷藏备用，得固定化酒用酸性脲酶。

2.用权利要求1方法制备的固定化酒用酸性脲酶的应用：其特征是该固定化酸性脲酶的最适温度为40℃，最适pH为4，贮存半衰期为71天；

在黄酒中加入该固定化酒用酸性脲酶后，加酶量：固定化酶重量/黄酒体积为100g/L，在动态的条件下，温度35℃，作用时间18h，去除酒样中80％的尿素，连续使用21次后，尿素去除率达51.6％。