[发明专利]一种提高乳杆菌制剂化存活率的方法

说明书

技术领域

一种提高乳杆菌制剂化存活率的方法。本发明为一种通过添加谷胱甘肽从而减少乳杆菌在冷冻干燥过程中的细胞死亡的方法。主要包括谷胱甘肽的添加和乳杆菌的冷冻干燥，属于生物工程技术领域。

背景技术

乳酸菌是一类重要的工业微生物，但是以乳杆菌为代表的益生菌菌株多为厌氧菌或兼性厌氧菌，在生长过程中，不形成芽胞，对外界胁迫条件的抗性较差，对环境中及加工处理环节的氧胁迫极为敏感，活性保持较为困难，导致进入市场的产品中活菌数量急剧下降，且产品的贮存稳定性极差，保健功效损失较快。针对乳酸菌在干燥和储存期间，高活性的保留这一瓶颈问题，国际上大多采用真空冷冻干燥法进行乳酸菌产品的制备。

研究发现，保护剂是影响冷冻干燥过程中细胞存活率的重要因素。通过在冷冻干燥前添加谷胱甘肽作为保护剂，可以减少乳杆菌在冷冻干燥过程中细胞的死亡率，从而增加乳杆菌制剂在其之后的使用过程中的适用能力。

张和平益生菌(Lactobacillus casei Zhang)是由内蒙古农业大学“乳品生物技术与工程”教育部重点实验室分离，具有乳杆菌共同的特性，与L.casei标准菌株ATCC 334的同源性为100％。益生乳酸菌L.casei Zhang进行了全基因组的测定和蛋白质组的研究，并通过了内蒙古科技厅组织的专家鉴定(内科鉴字2008第50号)。

唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)是龋齿活动状态的乳杆菌，具有乳杆菌共同的特性。是口腔的正常菌群，为革兰氏阳性兼性厌氧杆菌。Skerman VB等在1980年在Approved lists of bacterial names一文中对该菌株进行了验证。

发明内容

本发明的目的是提供一种提高乳杆菌制剂化存活率的方法，从而提高乳杆菌制剂在后续应用过程中的效能。

本发明的技术方案：一种提高乳杆菌制剂化存活率的方法，利用还原型谷胱甘肽的抗氧化性，在乳杆菌冷冻干燥过程中通过添加谷胱甘肽起到保护的作用，从而显著提高乳杆菌菌体在制剂化过程中的存活率，增强乳杆菌制剂在后续使用过程中的应用效能；

(1)乳杆菌的前处理过程：

a)挑乳杆菌单菌落接种到MRS培养液中，37℃静置培养过夜；

b)将步骤a)所得培养液离心去上清液后，获得的菌泥用生理盐水洗涤两次；

c)将洗涤后的菌体重悬于生理盐水中；

(2)冷冻干燥的预处理过程：

d)在步骤c)的菌悬液中添加谷胱甘肽(1％，w/v)，比例为1∶3(v/v，菌悬液：保护剂)，转移至冻干瓶；

e)将冻干瓶在-80℃冰箱中速冻12h过夜；

(3)冷冻干燥：

f)将步骤e)冷冻后的冻干瓶放入冷冻干燥机；

g)30h以后取出冻干瓶密封。

以抗氧化剂中的谷胱甘肽为保护剂保护乳杆菌在冷冻干燥过程中活性的损失。

相关培养基：

MRS培养基：蛋白胨10g/L，牛肉膏8g/L，酵母膏4g/L，葡萄糖20g/L，麦芽糖5g/L，醋酸钠5g/L，柠檬酸铵2g/L，吐温-80 1g/L，磷酸氢二钾2g/L，七水硫酸镁0.2g/L，四水硫酸锰0.05g/L，pH调节至6.2。

本发明的有益效果：一种提高乳杆菌制剂化存活率的方法，从而增强乳杆菌制剂在后续使用过程中的应用效能。主要包括谷胱甘肽的添加和乳杆菌的冷冻干燥。通过整套方法，可以在3-5天内快速的得到直投式乳杆菌发酵剂。谷胱甘肽作为冷冻干燥保护剂的添加，有效提高了乳杆菌在冷冻干燥过程的存活率，减少了乳杆菌制剂化过程中的死亡率，增加乳杆菌制剂在其之后的使用过程中的适用能力及活性。此外，由于谷胱甘肽对人畜安全无害并具有多种保健功能，这一思路可以用于直接食用发酵剂的制作过程。

具体实施方式

实施例1

按照上文所述方法，乳杆菌L.casei Zhang在MRS培养液中培养20h后离心洗涤获得菌体，2mL等体积重悬后，加入6mL谷胱甘肽(1％，w/v)作为保护剂，在-80℃冷冻过夜12h，使其完全形成固体冰状凝结物。迅速放入冷冻干燥机，在真空度为50mTorr的环境下冷冻干燥30h，于干燥后取出复水。与未添加谷胱甘肽作为保护剂的对照组相比，细胞在冷冻干燥后的存活率由3.6％提高到14.7％，存活率提高4.1倍。

实施例2

按照上文所述方法，唾液乳杆菌经预处理后加入菌悬液初始体积三倍的谷胱甘肽(1％，w/v)与脱脂奶粉(20％，w/v)作为混合保护剂，-80℃冷冻过夜12h后，在真空度为50mTorr的环境下干燥30h，于干燥后取出复水。与仅添加脱脂奶粉而未添加谷胱甘肽的对照组相比，细胞经相同冷冻干燥处理后的存活率由34.6％提高到51.0％。