[发明专利]猪瘟合成肽疫苗及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于猪瘟合成肽疫苗的多肽，以及含有该多肽的疫苗及它们的制备方法。

背景技术

猪瘟(Classical Swine Fever，CSF)是严重危害养猪业的重要病毒性传染病，其主要表现为特征性病理变化、内脏出血、梗塞和坏死，死亡率高达80％～90％，几乎遍及全世界(除北美洲和大洋洲外)，给养猪业造成重大的经济损失。国际动物卫生组织将猪瘟列入A类烈性传染病。猪瘟在自然条件下只感染猪，不同年龄、性别、品种的猪和野猪都易感，一年四季均可发生。此外患病和弱毒株感染的母猪也可以经胎盘垂直感染胎儿，产生弱仔猪、死胎等。该病的潜伏期一般为5～7天，根据临床症状可分为最急性、急性、慢性和温和型四种类型。

猪瘟病毒(CSFV)属黄病毒科(Flavividae)瘟病毒属(Pestivirus)，基因组为单股正链RNA病毒，大小约为12.3kb，含有一个开放阅读框架(ORF)，编码一个含3898aa的多聚前体蛋白。CSFV基因组由11个基因组成，已定位的蛋白有5种：Npro、C、E0、E1和E2，未明确定位的有6种：NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B，其中C为核衣壳蛋白，E0、E1和E2为结构糖蛋白，其余均为非结构蛋白。在结构蛋白中，最具有免疫防治研究价值的是E0和E2基因。

E2囊膜糖蛋白(gp55)是诱导机体产生中和抗体及激发保护性免疫应答的主要抗原蛋白，具有种属特异性。E2基因的变异将影响CSFV的免疫原性和抗原性。E2存在A、B、C和D 4个相对独立的抗原区域，而A又进一步分为A1、A2和A3三个亚区。A1、A2亚区在CSFV不同分离毒株间是保守的，而A3、B、C、D均呈不同程度的变异性。A、B和C区是中和抗原表位区，可诱导动物的中和反应，且A1和B、A1和C之间诱导的中和反应存在协同作用。在所有抗原区或亚区中，只有A1亚区诱导产生的单克隆抗体不仅对病毒感染具有中和作用，而且能识别所有CSFV分离毒株，并与相关病毒BVDV和BDV无交叉反应。因此，A1抗原区的精确定位及克隆、表达，对CSFV的诊断、免疫研究具有重要价值。A、B、C和D各区域的抗原表位数分别是：8、6、3和1，而A1、A2和A3的抗原表位数分别为：4、3和1。有研究进一步确定了E2蛋白上4个相对独立的抗原区域的抗原表位的位置：所有抗原位点均在E2的N端690～866的176aa之上，其中B的所有表位和C的一个表位位于第1～83aa残基之间，C区域的其它表位所处区域较宽，在第1～110aa残基之间，A1位于第86～176aa残基之间，A2、A3位于第86～123aa残基之间，D区域仅有一个抗原表位，位于第86～110aa残基之间。

目前已经报道的猪瘟B细胞线性表位有：E2上的TAVSPTTLR(aa829-837)、SPTTL(aa 289-293)、CTAVSPTTLRTEVVK(aa 828-842)、LFDGTNP(aa 772-778)和Erns上的DKN(aa 117-119)，这些抗原表位的确定将有助于促进猪瘟病毒的诊断分析和表位标记疫苗的发展。

传统疫苗是将病原体灭活或减毒制成的，存在生物危害性和遗传变异致使原疫苗效力丧失等问题。表位疫苗是用抗原表位制备的疫苗，是目前研制感染性疾病疫苗的方向。相对于传统的弱毒苗和灭活苗以及其他几种新型的疫苗，肽类疫苗安全、无毒、稳定，由于其分子结构小而简单，很少会出现严重的并发症及医源性感染问题。肽类疫苗可精确定位，合成T、B细胞抗原表位且可以进行不同的组合，制成针对多种病原体的疫苗。特别是可选用微生物中无突变的小片段制备合成肽疫苗。有些病原(如流感病毒)可通过快速而高频的突变逃避宿主免疫系统，若选择无突变的小肽片段作为疫苗就可克服其自身蛋白的局限性。研制合成多肽疫苗最重要的一步是寻找抗原表位。

解放军军需大学军事兽医研究所的刘思国等人在CSFV E2基因遗传变异分析的基础上，根据推导的氨基酸序列，通过计算机分析、预测E2蛋白的抗原表位，合成短肽。与抗mE2蛋白的兔血清(或单克隆抗体)进行反应，鉴定短肽的反应原性，并与载体蛋白(BSA)偶联后免疫实验动物，测定免疫原性。结果显示，仅其中一条多肽能产生抗体。Dong等报道合成5段猪瘟石门株B/C区693-777位氨基酸，偶联BSA制成合成肽苗，结果免疫猪能产生高滴度的抗体，并能完全保护强毒的攻击。以此多肽制备高免血清，此血清1∶4和1∶6稀释后能抑制C株的兔体热反应，而用合成多肽对高免血清进行亲和层析处理后，则不能抑制C株的兔体热反应。

发明内容