[发明专利]水溶性自组装壳聚糖纳米颗粒的制备方法和该壳聚糖纳米颗粒的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种水溶性自组装壳聚糖纳米颗粒的制备方法和该壳聚糖纳米颗粒的应用，具体地，涉及一种水溶性O-羟乙基壳聚糖自组装纳米颗粒的制备方法及其制得的纳米颗粒在制备水溶性自组装Trolox-壳聚糖纳米颗粒上的应用。 

背景技术

壳聚糖[β-(1-4)-2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖]是生物界中唯一存在的阳性氨基多糖，它是由甲壳素在碱性条件下水解脱乙酰基得到的。壳聚糖分子上存在着大量的游离氨基和羟基，因此它不但具有良好的保湿性和增湿性，而且还可以通过对其进行功能化修饰，拓展壳聚糖的应用范围；此外，它还具有无生物毒性、良好的成膜性、可生物降解性和较好的生物相容性等优点，因此近年来壳聚糖在保健食品、食品保鲜、化妆品、生物医药、植物病害的防治等领域显示了其独特的应用价值。 

但是，大分子量的壳聚糖水溶性差，这在很大程度上限制了它的应用。目前高水溶性壳聚糖的制备途径主要是通过降解的方法得到低分子量的壳聚糖，然后对其进行化学修饰，从而提高壳聚糖的水溶性；其中，氧化降解法是目前应用比较多的一种方法。化学修饰壳聚糖常用的试剂较多，本发明用到的环氧乙烷不但能够显著提高壳聚糖的水溶性，且修饰后的产物无毒无害，适合进一步利用。 

近几年来，水溶性壳聚糖纳米颗粒因具有良好的负载能力，被广泛应用于负载基因、蛋白质及药物等生物活性物质。但目前制备的壳聚糖纳米颗粒粒径大多在100nm以上，而纳米颗粒在生物体内的吸收利用与其尺寸有一定关系，粒径越小越能促进生物活性分子的有效吸收。因此，制备小粒径壳聚糖纳米颗粒对基于壳聚糖纳米颗粒载体的开发，提高生物活性分子的利用度具有重要的意义。目前，制备壳聚糖纳米颗粒的主要方法有：共价交联法、沉淀析出法、自组装法等；共价交联法往往会影响到大分子的释放，不利于壳聚糖纳米颗粒在生物医药等领域的应用；沉淀析出法为非均相反应，制备条件苛刻。因此，本发明采用自组装法制备壳聚糖纳米颗粒，由此得到的壳聚糖纳米颗粒粒径较小，范围为20～80nm。 

Trolox，又称水溶性维生素E，是一种过氧化物自由基清除剂。由于其具有很好的膜穿透能力，被广泛应用于生物领域的抗氧化研究。但Trolox在水溶液中的溶解度较低(0.5mg/ml)，通常需要二甲基亚砜或乙醇助溶，从而提高Trolox的工作浓度，但少量的二甲基亚砜或乙醇不可避免会对细胞或生物体产生一定的毒性。 

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种尺寸可控的、粒径较小的水溶性O-羟乙基壳聚糖纳米颗粒的制备方法。 

本发明的另一目的是将制备的水溶性O-羟乙基壳聚糖纳米颗粒作为抗氧化剂Trolox载体，在不使用助溶剂的情况下，将Trolox包裹进入壳聚糖纳米颗粒，从而增加Trolox的溶解度，通过缓释形式延长Trolox的释放时间，实现RAW264.7细胞对Trolox的充分吸收和利用。 

本发明提供的一种水溶性O-羟乙基壳聚糖自组装纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤： 

(1)将氧化剂加入到pH值为1～4的壳聚糖酸性水溶液中，升温至40～80℃，搅拌2～9h，；停止搅拌后，加氢氧化钠水溶液调节反应体系的pH值至10～12，得低分子量壳聚糖的碱性水溶液； 

(2)控温4～5℃；搅拌，将环氧乙烷分多次加入到低分子量壳聚糖的碱性水溶液中，得水溶性O-羟乙基壳聚糖，其中，加入的总的环氧乙烷与低分子量壳聚糖的碱性水溶液的体积比为1∶8～12； 

(3)控温40～80℃；在水溶液中进行自组装，搅拌40～120h后得水溶性O-羟乙基壳聚糖自组装纳米颗粒溶液。 

其中，步骤(1)中所述壳聚糖酸性水溶液中的酸可以为乙酸或盐酸。 

步骤(1)中所述壳聚糖酸性水溶液中的壳聚糖浓度较佳为5～20g/L。 

步骤(1)中，所述氧化剂可以为高硼酸钠或双氧水，壳聚糖酸性水溶液中的壳聚糖与加入的所述氧化剂的重量比12～30∶1。较佳地，选用高硼酸钠时，壳聚糖和高硼酸钠投料比为150∶5～150∶12；选用H₂O₂时，壳聚糖和H₂O₂投料比为30∶1～15∶1。 

步骤(1)、(2)和(3)中搅拌速度可以为200～6000r/min。较佳为500～2000r/min。 

较佳地，步骤(1)和(3)中，反应温度控制在40～80℃；步骤(2)中，加入环氧乙烷时的温度控制在0～10℃。