[发明专利]一种手足口病单、双价灭活疫苗及其制备方法

权利要求书

1.一种预防手足口病的单价或双价灭活疫苗的制备方法，其特征在于该方法包括如 下步骤：

a,选育手足口病疫苗株；

b,建立并检定疫苗株三级种子批库；

c,培养细胞；

d,在细胞长成致密单层或微载体培养细胞成合适密度时，接种病毒；

e,在细胞中增殖病毒；

f,收集细胞所产生的病毒悬液，澄清过滤，去除细胞残渣；

g,用灭活剂灭活病毒；

h,超滤浓缩后的病毒悬液，通过凝胶过滤层析和离子交换层析纯化病毒液，或者通

过蔗糖密度梯度离心纯化病毒液，得纯化的病毒原液，即抗原；

i,配制及检定单、双价灭活疫苗半成品及成品，测量疫苗的安全性、有效性及稳定

性;

该单价灭活疫苗由Cox.A16抗原与Al（OH）₃佐剂按下述重量比配制而成：

Cox.A16抗原              0.0015-0.002重量份

Al（OH）₃佐剂            0.25-0.5重量份；

该双价灭活疫苗由EV71抗原和Cox.A16抗原与Al（OH）₃佐剂按下述重量比配制而 成：

EV71抗原和Cox.A16抗原    共0.0015-0.002重量份

Al（OH）₃佐剂            0.25-0.5重量份；

其中EV71抗原和Cox.A16抗原的比例为1：1。

2.如权利要求1所述的单价或双价灭活疫苗的制备方法，其特征在于：

其中b步骤建立并检定疫苗株三级种子批库的方法为：经过噬斑纯化的Vero细胞上 的4代毒种原始种子批；验明原始种子批的记录、历史、来源和生物学特性；从原始种 子批在Vero细胞上传至第5代为主种子批；主种子批在Vero细胞上继续传代总次数不 超过12代制备工作种子批。

3.如权利要求1或2所述的单价或双价灭活疫苗的制备方法，其特征在于：

其中c步骤中所用的细胞是从ATCC引进获得常规用于增殖肠道病毒的Vero细胞系 的细胞，由工作Vero细胞库复苏，经传代扩增得到；细胞的培养方法为：将用于疫苗生 产的Vero细胞系细胞在15L转瓶内以1：6比例分种，培养3天后接种肠道病毒；或者 在发酵罐内或在WAVE生物反应器中进行，其中，在发酵罐内进行时要使用微载体，使用 浓度为1-10g/L。

4.如权利要求1所述的单价或双价灭活疫苗的制备方法，其特征在于：

其中d步骤中微载体培养细胞成合适密度是指细胞密度达到3×10⁶/ml时接种病毒； 以0.001-0.01的感染复数（MOI）接种病毒。

5.如权利要求1所述的单价或双价灭活疫苗的制备方法，其特征在于：

其中f步骤的具体方法为：将细胞培养达到预定的时间后，通过常规方法收集，冻 融3次，离心去除细胞沉渣，收获病毒，通过滤器澄清过滤，滤器孔径为0.45μm。

6.如权利要求1所述的单价或双价灭活疫苗的制备方法，其特征在于：

其中g步骤中灭活病毒使用WHO规定的灭活剂和灭活条件：采用甲醛作为灭活剂， 使用浓度1：4000，灭活温度37℃，灭活时间为3天；或采用β－丙内酯作为灭活剂， 按1:4000在2～8℃灭活2天。

7.如权利要求1所述的单价或双价灭活疫苗的制备方法，其特征在于：

其中h步骤中超滤浓缩时使用的超滤膜的截留分子量为200-300KD，浓缩倍数为 50-100倍。