[发明专利]一种快速检验细菌的试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测试剂盒，具体地说，涉及一种利用复合酶的 PCR技术进行快速检测细菌的试剂盒及其检测方法，属于微生物检测 领域。

背景技术

人们的生活水平不断提高，逐步从温饱迈向小康。人们对食品的 要求已从过去的买得起足够的食品，转为希望买到质量好、卫生安全 的食品。食品的质量、卫生安全则成为广大消费者的主要追求。因此 微生物对食品的污染问题，尤其是细菌对食品的污染问题相应地备受 关注，在食品生产、加工、储存、运输、销售等各个环节中都有污染 细菌的可能，一旦污染，细菌将大量繁殖而引起食品腐败变质，或导 致食源性感染和食物中毒，特别是近年来随着环境污染的加剧和生态 平衡的不断破坏，可导致人类感染的致病菌种类越来越多，病原菌对 人类的威胁越来越大。为了防止此类事件的发生，采用适当的快速检 验方法来对食品进行检测，是预防食源性中毒的重要手段。(范讌萍， 王婷，梁炎，快速检验纸片在食品微生物检测中的应用，中国医药指 南，2008年10月：48-49)

目前，常规的微生物和细菌检测主要是通过培养基来培养目标， 通常情况下，将1mL(经过稀释)样本置于溶化的营养琼脂内，使菌 培养成离散的菌落，并在约24h内进行菌落形成单位(CFU/mL)计 数。这些菌落可进行分离，并进一步鉴定它们属于致病菌或非致病菌， 培养时间从2-3天，到数周不等。实验需要用到大量的器皿、试剂。 而且检测要有专门的实验室，由专门的技术人员进行无菌操作。此方 法极易受到污染而导致错误结果，不但检测时间长，还浪费大量的人 力、物力、财力。

而微生物学和细菌学的快速检测方法，人们从20世纪60年代中期 就开始进行研究，70年代该领域发展快速，并在80年代、90年代持续 发展，直至现在。

目前微生物学和细菌学的快速检测大致分为以下几类：第一类是 活细胞计数。一些方便的系统装置，如具有营养培养基的快速测试片 Petrifihn；将样本散布在预成的琼脂平板表面的快速螺旋接种仪Spiral Plater；将微生物捕集在细菌滤膜上的网格滤膜系统Isogrid或捕集在小 井组中的微生物检测系统BioCotrol Simplate；非热凝胶“琼脂”系统 Easygel等，以及在选择性培养基或非选择性培养基上寻找生长的靶标 等系统，有助于大大地缩减活细胞计数的完成时间。总体来说，活细 胞计数比传统的方法检测速度有所提高，但提高的有限，仍需人工计 数。

第二类为仪器检测，液体和半固体样本内致病菌和非致病菌菌群 的生长动力学和动态的变化可使用仪器自动检测，如ATP水平、专一 性酶、pH值、电阻抗、导电系数、电容、浊度、颜色、热度、放射 性二氧化碳等。但这些检测仪器较昂贵，而且实验操作较复杂，所需 的检测时间最少为4小时(冯贻泽，食品微生物学的快速检测方法和 自动化操作：25年回顾和预测，中国食品学报，2009年4月：1-3)。

还有一类为核酸检测。通过已知探针进行DNA与RNA的杂交已 经使用30年之久。近年来，PCR已经被人们所接受。聚合酶链式反 应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术， 通过一对特异的引物来放大特定微生物或细菌的DNA片段。可看作生 物体外的特殊DNA复制。并通过琼脂糖电泳来检测靶标PCR产物，可 用于检测病毒、细菌甚至霉菌和酵母菌等。但传统的PCR反应由于酶 的限制，导致PCR循环至少要进行1个半小时，而使整个检测时间超 过2个小时。

经文献检索，未发现与本发明内容相同文献的公开报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速检测细菌的试剂盒，其利用复合酶 的PCR技术，可定性的检测所有细菌，并大大缩短了细菌的检测时间。

为了实现本发明目的，本发明的一种快速检测细菌的试剂盒，其 以热启动酶和高保真酶为复合酶，酶活比为1∶1-3∶2。

其中，二者的酶活比优选为3∶2。

所述热启动酶为Phire Hot Start DNA Polymerase(Finnzymes， 芬兰)、DyNAzyme II Hot Start DNA Polymerase(Finnzymes，芬兰) 或GoTaq Hot Start DNA Polymerase(Promega，美国)。