[发明专利]发酵生产α-葡萄糖基化丁香酚的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及利用野油菜黄单胞菌(Xanthomonascampestris)CGMCC NO.1243发酵生产α-葡萄糖基化丁香酚的方法。

背景技术

丁香酚具有抑菌、抗氧化、抗肿瘤、促进头发生长等多种药理活性。然而其难溶于水、易升华、有刺激性气味等性质，限制了它的应用。因此，研究对其进行结构改造设计成前药，从而改变物理性质，使它能够得到广泛应用。

近年来葡萄糖基化被认为是改造酚类化合物结构，保留其生物活性，提高水中的溶解性，增强药理作用，使酚类化合物具有靶向性的一种重要方法。因此，可以将丁香酚改造为α-葡萄糖基化丁香酚。

目前，国内利用生物技术生产α-葡萄糖基化丁香酚的文献尚未见报道；国外生产α-葡萄糖基化丁香酚的方法主要是提取α-葡萄糖基转移酶，催化麦芽糖和丁香酚合成α-葡萄糖基化丁香酚。由于α-葡萄糖基转移酶的提取过程繁琐，费用昂贵，所以α-葡萄糖基化丁香酚的生产成本很高。而且该法的反应体系小，产率不高，给实际推广带来了很大的困难。因此，有必要发展一种低成本，高产率，利于大规模生产α-葡萄糖基化丁香酚的制备方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种α-葡萄糖基化丁香酚的制备方法，该制备方法利用野油菜黄单胞(Xanthomonas campestris)CGMCC NO.1243，选用合适的培养基在最适培养条件下培养一定时间，加入反应物丁香酚和麦芽糖(或蔗糖)，在最佳反应条件下发酵生产α-葡萄糖基化丁香酚，发酵液经过大孔吸附树脂的分离纯化后，可得到高纯度的α-葡萄糖基化丁香酚。该方法克服了提取酶催化成本高、操作繁琐、反应体系小、产率低的缺点。而且该方法能够利用蔗糖，具有工艺操作简单、反应条件温和、成本低、产率高、操作安全等优点。

本发明的整体技术构思是：

发酵法生产α-葡萄糖基化丁香酚，该方法由下列工艺步骤组成：

(1)将野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)CGMCC NO.1243菌种接种到试管中的斜面培养基制成斜面菌种；

(2)将斜面菌种接入摇瓶中进行发酵

(3)加入反应物丁香酚和麦芽糖(或蔗糖)

(4)α-葡萄糖基化丁香酚的分离纯化

本发明的具体工艺步骤及工艺条件是：

步骤(1)中的斜面培养基由下列重量份组分组成：

麦芽糖(或蔗糖)5-50份、蛋白胨1-15份、酵母粉1-12份、磷酸氢二钾2.0份、无水硫酸镁0.5份、碳酸氢钙0.05份、琼脂10-20份和水1000份；

制备斜面菌种的工艺条件为：pH值为6.0-9.0，温度为15-40℃，培养时间为12-60小时。

步骤(2)中的发酵液由下列重量份组分组成：

麦芽糖(或蔗糖)5-50份、蛋白胨1-15份、酵母粉1-12份、磷酸氢二钾2.0份、无水硫酸镁0.5份、碳酸氢钙0.05份和水1000份；

发酵的工艺条件为：pH值为6.0-9.0，培养温度为15-40℃，摇床转速为90-230转/分钟，培养时间为18-72小时。

步骤(3)中的反应条件为：反应温度为10-45℃，摇床转速为90-230转/分钟，pH值为4.0-10.0，反应物丁香酚浓度为60-150mmol/L，麦芽糖(或蔗糖)浓度为100-500mol/L，反应时间为24-120小时。在此反应条件下，丁香酚的转化率为63-91％，每升发酵液中含α-葡萄糖基化丁香酚16.5-37g。

步骤(4)中的α-葡萄糖基化丁香酚的分离纯化包括以下四个步骤：

a.对发酵完成的发酵液进行预处理：发酵液过滤除去沉淀；

b.将经过a步骤的发酵液在6000转/分钟条件下离心20分钟；

c.把经过b步骤的发酵液通过弱极性大孔吸附树脂柱进行分离纯化，弱极性大孔吸附树脂柱为AB-8柱；

d.把经过c步骤的发酵液真空干燥，即可得到纯度为97％以上的α-葡萄糖基化丁香酚，真空干燥的真空度为0.1Mpa，温度为60℃，干燥后的成品为白色粉末。

本发明所用的野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)CGMCC NO.1243已经在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为野油菜黄单胞菌CGMCC NO.1243。

本发明所取得的技术进步在于：