[发明专利]筛查检测线粒体DNA片段缺失的序列、试剂盒及筛查检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域。具体地说，涉及线粒体DNA片段缺失筛查检测的核苷酸序列、试剂盒和筛查检测方法，以及它们的应用。 

背景技术

线粒体是哺乳动物(包括人类)细胞内最重要的细胞器之一，它的功能是参与细胞内糖类、脂类、蛋白质等物质的代谢，为细胞提供能量来源。同时，线粒体还参与血红蛋白合成、尿素代谢、氧自由基等重要物质的代谢活动。除此之外，线粒体还是细胞凋亡的信号枢纽，决定每个细胞的生存与死亡。因此线粒体的功能异常与生长、发育、衰老、肿瘤、免疫等重要的生理和病理状态有关。每个线粒体都有很多线粒体DNA分子，这些DNA分子是真核细胞除细胞核以外唯一存在的DNA分子，它们编码37个与线粒体功能密切相关的重要基因。线粒体DNA分子的重要特征之一在于没有内含子，因此每个编码基因之间相互连接甚至有部分重叠。在这种状态下，每个线粒体DNA片段的缺失都会造成线粒体DNA编码基因的不完整，从而出现其编码蛋白质的功能缺陷。如果人体内的每个细胞内的线粒体蛋白都有一定的缺陷，那么将给健康带来灾难性的后果，这就是为何由线粒体DNA片段缺失造成的疾病都很严重而且影响多个器官的重要原因。患有此种疾病的患者的健康状态很差，寿命较短，更甚之，这类疾病有些可以遗传，有些是获得性的，因此对于此类疾病的筛查与诊断具有极其重要的临床意义。 

线粒体DNA(mt DNA)本身是一个环形的双链DNA分子，正常人的线粒体DNA的长度是固定的，如果发生了线粒体DNA片段缺失，一个正常的线粒体DNA分子的环将缩小，所缩短的长度即所缺失的长度。到目前为止，在全世界范围内发现的导致人类疾病的各种线粒体DNA缺失有107种，其中有85％的缺失范围在轻链序列第5098至第15913位碱基之间。然而目前这些已经发现的线粒体DNA缺失都是通过各种不同的方法发现的，尚未 有一种简单、通用的方法能够快速做出检测。 

在罹患与线粒体相关的疾病的患者或具有罹患该疾病风险的携带者的每个肌肉细胞或血液的有核细胞内，通常携带有正常的线粒体DNA和发生了片段缺失的线粒体DNA，通过PCR扩增这两类DNA分子，并且利用琼脂糖凝胶电泳可将两类扩增片段分开。因此只要在扩增及电泳后，在同一电泳道内存在两条或两条以上条带的，即为线粒体DNA片段缺失的携带者，或者患者。这种检测可以满足临床或实验室做出分子诊断的需求，医生可以根据需要选择其他的诊断方法进行相互验证。 

发明内容

为了解决现有技术中的问题，本发明的一个目的在于提供一组检测线粒体DNA片段缺失的核苷酸序列，用于线粒体DNA片段缺失的快速、准确检测。 

本发明的另一个目的在于提供一种用于临床和实验室筛查检测线粒体DNA片段缺失的试剂盒，实现了线粒体DNA片段缺失的简单、准确、快速地检测。 

本发明的另一个目的在于提供一种用于临床和实验室筛查检测线粒体DNA片段缺失的方法，实现了线粒体DNA片段缺失的简单、准确、快速地检测。 

根据本发明的一个方面，该检测线粒体DNA片段缺失的核苷酸序列由SEQ ID NO.1所示的序列和SEQ ID NO.2所示的序列组成，用作扩增引物。 

根据本发明的一个方面，该试剂盒包括引物A、引物B、公共液C，引物A的核苷酸序列为：5′TCC TAA CTA CTA CCG CAT TCC TAC TAC 3′(SEQID NO.1)，引物B的核苷酸序列为：5′TTT CAT CTC CGG TTT ACA AGACTG 3′(SEQ ID NO.2)，两种引物分别对应于人类线粒体DNA轻链序列的第5098-5124位碱基和第15913-15936位碱基，公共液C为等量混合的dATP、dTTP、dCTP、dDTP核苷的无菌双蒸去离子水溶液。 

根据本发明的一个方面，利用本试剂盒扩增正常人线粒体DNA分子可得到10815bp片段，而可以检测到的线粒体DNA缺失片段长度在100bp～10.8kb之间，且缺失片段位于人类线粒体DNA轻链序列的nt5098-nt15936 之间。 

根据本发明的一个方面，本发明试剂盒可为50次反应容量(按照每次100μl总反应体系计算)，具体地包括引物A和引物B粉末各10nmol，每种引物单独封装于1.5ml Eppendorf管内，反应公共液C 4.5ml，于白色塑料瓶内封装很显然，本领域已知或未来常规使用的其它贮藏容器也可用于本发明。