[发明专利]一株耐盐的苜蓿中华根瘤菌NSM18及其专用基因簇

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一株耐盐的苜蓿中华根瘤菌NSM18及其专用基因簇。

背景技术

干旱和土壤盐渍化是农业所面临的一个主要问题，特别在干旱或半干旱气候条件下尤为突出。据估计，全世界大约有40％的可耕地都存在盐过量的现象，受盐渍化影响的集约农业的农田面积可达到4.0～9.5亿公顷。更为严重的是，因受厄尔尼诺气候的影响，全球气温升高，海平面上升，加之工业污染和农业灌溉、施肥不当等人为因素的影响，次生盐碱化土壤的面积还在以每年3％的速度扩展。利用生物工程技术提高农作物、农用微生物的抗逆性是改良利用盐渍化土壤经济有效的方法之一，而与耐盐有关基因的资源是实施生物工程改良利用盐渍化土壤的物质基础。目前，我国一方面由于缺乏与耐盐有关的基因的开发和利用，特别是缺乏有效的耐高盐基因，另一方面因受知识产权等因素的影响，某些国外与耐盐相关基因的转化利用受到限制，这些严重制约了我国生物工程改良利用盐渍化土壤的进程。因此，挖掘耐盐生物种质资源的潜力，拓宽遗传基础，对存在于中度嗜盐菌中的与耐盐有关基因或调节因子进行克隆分离，并以基因工程的手段转移到其它微生物中，对于打破物种限制，实现种间、种外外源基因的转移或累加，对构建耐盐的工业生产用菌、开发利用盐碱地和增加粮食产量等方面具有广阔的应用前景。

根瘤菌是一类重要的土壤微生物，可与相应的豆科的植物共生固氮。发展和开发其共生固氮系统是解决农业可持续发展的一个办法。共生固氮系统能合成最廉价的蛋白质，对人类与动植物的营养具有相当重要的作用。然而，盐胁迫导致生物固氮的迅速下降，以致造成蛋白质产量的显著降低。同时，独立生活的根瘤菌在土壤中也受到相同的盐胁迫的影响，繁殖能力大大地降低，而且其在植物根部的定殖也大受影响，造成结瘤能力的下降。因此，从具有高度耐盐能力的中度嗜盐菌中克隆与耐盐有关基因，并转化根瘤菌，构建耐盐高效的共生系统必将有益于农业的持续性发展。

本发明人以往尝试过其它与耐盐相关基因，比如甘氨酸甜菜碱合成和转运基因。虽然该基因可以不同程度地增强转基因微生物对多种逆境胁迫的抗性，但是受制于其关键前体物(胆碱)的供给，这些基因所获得的转基因产品通常积累的甘氨酸甜菜碱的量很低(约0.05-5μmol·g^-1FD)，限制了其在耐盐基因工程中的应用。相比较而言，本发明中所使用的四氢嘧啶基因是从头合成基因，不需要特殊底物的存在，也不需要特殊的转运系统，对底物要求不高，而且，已有在植物中表达四氢嘧啶合成基因能提高高渗冲击的耐受能力的报道。但是，在微生物不同种属间的转移和表达还未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一个基因簇(命名为ectABC)，是从一株能在4mol/LNaCl条件下生长的革兰氏阳性放线菌喜盐涅斯捷连科氏菌(Nesterenkonia halobia)DSM 20541中克隆出的四氢嘧啶合成基因。

本发明提供的基因簇，为如下1)-4)中任一种：

1)其核苷酸序列是序列表中序列1的自5′末端第1809-5236位脱氧核糖核苷酸；

2)其核苷酸序列是序列表中的序列1；

3)在严格条件下与1)或2)的基因杂交且与四氢嘧啶合成相关的DNA分子；

4)与1)或2)的基因具有90％以上的同源性且与四氢嘧啶合成相关的DNA分子。

序列表中序列1有5496个碱基，其中自5’端第2047-2575位为ectA的编码区，自5’端第2746-4030位为ectB的编码区，自5’端第4238-4625位为ectC的编码区。

所述的严格条件是指，将杂交膜置于预杂交液(0.25mol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，7％SDS)中，65℃预杂交30min；弃预杂交液，加入杂交液(0.25mol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，7％SDS，同位素标记的核苷酸片段)，65℃杂交12hr；弃杂交液，加入洗膜液I(20mmol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，5％SDS)，65℃洗膜2次，每次30min；加入洗膜液II(20mmol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，1％SDS)，65℃洗膜30min。

含有上述基因簇的重组载体也属于本发明的保护范围之内。